苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組及其系統(tǒng)發(fā)育研究

薛清 杜虹銳 薛會(huì)英 王譯浩 王暄 李紅梅

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院， 林芝 860000）

滑刃線蟲(chóng)屬（AphelenchoidesFischer，1894）已報(bào)道種類(lèi)約200種，大多數(shù)種類(lèi)取食真菌，有13個(gè)種類(lèi)為兼性植物寄生線蟲(chóng)，具有廣泛的寄主范圍［1］。貝西滑刃線蟲(chóng)（A. besseyi）、草莓滑刃線蟲(chóng)（A.fragariae）和菊花滑刃線蟲(chóng)（A. ritzemabosi）因其對(duì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響而受到廣泛的關(guān)注和研究，它們的典型寄主分別為水稻、草莓和菊花，并引起水稻干尖病、草莓夏矮病和菊葉線蟲(chóng)病［2-4］。針對(duì)其他植物寄生性滑刃線蟲(chóng)種類(lèi)的研究則相對(duì)缺乏。

苜蓿滑刃線蟲(chóng)A. medicagus是新近描述的一種滑刃線蟲(chóng)［5］。該線蟲(chóng)分離自寧波口岸進(jìn)境的美國(guó)干苜蓿草，可在鏈格孢菌（Alternariasp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等多種真菌上完成生活史，同時(shí)對(duì)大豆和苜蓿具有弱寄生性［6］。系統(tǒng)發(fā)育研究顯示，苜蓿滑刃線蟲(chóng)與貝西滑刃線蟲(chóng)、福建滑刃線蟲(chóng)（A. fujianensis）親緣關(guān)系較近［5］，但其隸屬的滑刃線蟲(chóng)屬在墊刃亞目（Tylenchina）中的分類(lèi)地位尚未完全解析，特別是與真滑刃線蟲(chóng)屬（Aphelenchus）的高階元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍然存在較多的爭(zhēng)議［7-8］。現(xiàn)有的線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育研究大多基于核糖體RNA與線粒體COI基因，這些基因的片段一般較短（常用片段約為450-1 600 bp），所含信息量有限，難以完全解析各物種間的進(jìn)化關(guān)系。動(dòng)物線粒體基因組一般在10 kb以上，兼具編碼與非編碼區(qū)域，富含豐富的遺傳信息，其中基因結(jié)構(gòu)排列、核苷酸和氨基酸序列，都可成為研究進(jìn)化關(guān)系的良好靶標(biāo)。因此，基于線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育已成為近年來(lái)分類(lèi)進(jìn)化研究方向的熱點(diǎn)之一［9］。

線蟲(chóng)線粒體基因組的研究相比其他動(dòng)物類(lèi)群起步較晚，目前已完成的線粒體基因組測(cè)序絕大多數(shù)集中于重要的動(dòng)物寄生線蟲(chóng)，而植物寄生類(lèi)和土壤腐生類(lèi)的線蟲(chóng)鮮有報(bào)道［10］。滑刃線蟲(chóng)屬種類(lèi)眾多，然而目前僅有貝西滑刃線蟲(chóng)完成了線粒體全基因組測(cè)序［11］。造成這種現(xiàn)象的重要原因之一是現(xiàn)有的線蟲(chóng)線粒體基因組測(cè)序大多采用操作難度較大的長(zhǎng)PCR擴(kuò)增法，該方法是根據(jù)已有的線粒體基因組信息，設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物進(jìn)行長(zhǎng)片段的擴(kuò)增與測(cè)序［11-13］。然而，線蟲(chóng)種間的線粒體基因差異較大，且可供參考的線蟲(chóng)線粒體基因組較少，因此可能會(huì)導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)存在較大盲目性，使實(shí)踐操作中成功擴(kuò)增長(zhǎng)片段變得困難。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為線粒體基因組測(cè)序提供了新的策略，已經(jīng)在多種生物中獲得了較好的結(jié)果［14］，然而該方法尚未在線蟲(chóng)的線粒體基因組研究中得到廣泛應(yīng)用。目前采用高通量測(cè)序法僅完成了艾靈頓球孢囊線蟲(chóng)（Globodera ellingtonae）和哥倫比亞紐帶線蟲(chóng)（Hoplolaimus columbus）線粒體基因組測(cè)序與組 裝［15-16］，尚未見(jiàn)其他線蟲(chóng)類(lèi)群的國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道。

本研究利用二代測(cè)序技術(shù)Illumina平臺(tái)對(duì)苜蓿滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行低覆蓋全基因組測(cè)序，從獲得的原始數(shù)據(jù)中提取線粒體信息，通過(guò)多種方法組裝線粒體基因組后，對(duì)線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)和排列、堿基組成，蛋白編碼基因和密碼子使用情況，以及RNA基因和非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)合已發(fā)表的線蟲(chóng)線粒體基因組序列對(duì)苜蓿滑刃線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為滑刃線蟲(chóng)的分類(lèi)與線粒體基因組研究提供新的科學(xué)方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試苜蓿滑刃線蟲(chóng)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室在灰葡萄孢平板上保存的純培養(yǎng)，為該種描述時(shí)使用的模式群體［5］。挑取300條線蟲(chóng)用無(wú)菌蒸餾水清洗后，放入裝有8 μL蒸餾水的200 μL PCR管中。采用液氮凍融法進(jìn)行線蟲(chóng)DNA的粗提，將PCR管在液氮中冷凍1 min，然后迅速放入65℃水浴鍋中溶解2-3 min，重復(fù)凍融步驟3次后，向PCR管中加入100 mg/mL蛋白酶K 1 μL和10×PCR緩沖液1 μL，混勻后于65℃保溫1.5 h，然后于95℃保持15 min。使用Qubit 1x ds DNA HS檢測(cè)試劑盒及 Qubit?3.0型熒光定量?jī)x測(cè)定 DNA溶液的濃度。

1.2 方法

1.2.1 組裝種子序列的獲取 本研究采用線粒體COI基因部分序列作為種子，用于線粒體基因組組裝的起始序列。采用引物對(duì)COI-F1（5'-CCT ACT ATG ATT GGT GGT TTT GGT AAT TG-3'）與COI-V2（5'-GTA GCA GCA GTA AAA TAA GCA CG-3'）擴(kuò)增COI基因片段，預(yù)測(cè)片段大小約為720 bp［17］。擴(kuò)增體系為25 μL，含有DNA模板1 μL、濃度10 μmol/L的上游和下游引物各2 μL、100 μmol/L dNTPs 2 μL、10×ExTaq PCR緩沖液2.4 μL、25 mmol/L MgCl22 μL以 及5 U/μL ExTaq酶0.1 μL，加ddH2O補(bǔ) 足 至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 2 min，循 環(huán)42次；72℃延 長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，由北京擎科生物科技有限公司采用Sanger法進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 高通量測(cè)序與線粒體基因組組裝 采用標(biāo)準(zhǔn)的 Illumina TruSeq Nano DNA LT文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建苜蓿滑刃線蟲(chóng)DNA樣本所需的基因組上機(jī)文庫(kù)，由南京派森諾基因科技有限公司使用 Hiseq X ten PE150平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序產(chǎn)生2 Gb數(shù)據(jù) 量，得到低覆蓋全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。采用FSATP［18］對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除接頭污染，過(guò)濾掉長(zhǎng)度低于50 bp、Q值低于20或n數(shù)量大于3的reads。

從GenBank中下載貝西滑刃線蟲(chóng)（A. besseyi）、傷殘短體線蟲(chóng)（Pratylenchus vulnus）、香蕉穿孔線蟲(chóng)（Radopholus similis）、燕麥真滑刃線蟲(chóng)（Aphelenchus avenae）、秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）、大豆孢囊線蟲(chóng)（Heterodera glycines）以及花生根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne arenaria）等7種線蟲(chóng)的線粒體基因組序列作為參考基因組。在Linux系統(tǒng)下使用NextGenMap［19］根據(jù)線粒體基因組參考序列快速比對(duì)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，比對(duì)閾值設(shè)定為0.3。通過(guò)SAMtools［20］提取比對(duì)結(jié)果中至少在單向符合要求的候選線粒體序列。利用上述獲得的COI基因擴(kuò)增序列作為“種子”，結(jié)合自定義循環(huán)腳本與NOVOPlasty的種子序列擴(kuò)展（seed-extend）算法，對(duì)已提取的線粒體基因組進(jìn)行組裝。使用MitoZ［21］軟件并結(jié)合已發(fā)表的貝西滑刃線蟲(chóng)［11］線粒體基因組信息，對(duì)獲得的苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組進(jìn)行注釋。根據(jù)基因組初步組裝結(jié)果，在nad4與cox1兩個(gè)基因上分別設(shè)計(jì)正向引物AM_F（5'- TTA TAC TCT ATT CGT TTT AGT GTC AGG TTT-3'）與反向引物AM_R（5'- TCA AAC AGC AAA ACC ACC TTG ATA CT-3'），以擴(kuò)增非編碼片段。PCR采用 Prime STAR MAX酶，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，48℃ 30 s，62℃ 2 min，循 環(huán)38次；62℃延 長(zhǎng)10 min。最后，將基因組組裝結(jié)果與擴(kuò)增獲得的非編碼區(qū)進(jìn)行拼接，將拼接后的基因組序列上傳至GenBank，登錄號(hào)為MZ424209。

1.2.3 基因注釋與系統(tǒng)發(fā)育研究 采用MITOS在線服 務(wù)（http：//mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）對(duì)組裝的線粒體基因組進(jìn)行注釋［22］，并結(jié)合貝西滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組已有的注釋對(duì)其進(jìn)行修正。利用MITOS軟件的MiTFi 程序?qū)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù) 測(cè)［23］，并 用FORNA（http：//rna.tbi.univie.ac.at/forna）［24］軟件繪制tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。

為研究苜蓿滑刃線蟲(chóng)在線蟲(chóng)門(mén)的系統(tǒng)發(fā)育地位，使用線蟲(chóng)門(mén)31個(gè)不同種類(lèi)的線粒體基因組作為參考序列，以科斯格羅夫異索蟲(chóng)（Thaumamermis cosgrovei）作為外群構(gòu)建基于極大似然法的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用Geneious7.1.3軟件將12個(gè)蛋白編碼基因（PCGs）按照無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體密碼子分別轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，并在MAFFT軟件中進(jìn)行多重比對(duì)［25］。采用SMS軟件［26］對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行評(píng)估，選擇的模型為MtZoa+G+I+F。按照nad6-nad5-nad4-nad4Lnad3-nad2-nad1-cytb-cox3-cox2-cox1-atp6的順序構(gòu)建序列矩陣，利用CIPRES運(yùn)算平臺(tái)［27］的RAxML v8.2.12［28］軟件進(jìn)行1 000次bootstrap運(yùn)算，獲得極大似然自舉值（BS），構(gòu)建極大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)與 排列

苜蓿滑刃線蟲(chóng)DNA樣本經(jīng)Hiseq X ten PE150平臺(tái)測(cè)序共獲得213 159 776條原始序列，通過(guò)質(zhì)控處理后得到211 293 116條高質(zhì)量序列，占總原始序列的99.12%，測(cè)序總體質(zhì)量較高。與7種線蟲(chóng)的線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)和過(guò)濾后，共獲得線粒體序列1 430 492條，占獲得高質(zhì)量序列的0.68%。拼接共獲得13 890 bp序列，為典型的閉合雙鏈DNA分子（圖1）。

圖1 苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組結(jié)構(gòu)與基因排列順序Fig.1 Genome structure and gene arrangement in A. medicagus

通過(guò)線粒體基因組基因排列順序研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿滑刃線蟲(chóng)與貝西滑刃線蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的基因排列完全一致，而與燕麥真滑刃線蟲(chóng)及根結(jié)線蟲(chóng)、孢囊線蟲(chóng)、短體線蟲(chóng)等墊刃類(lèi)線蟲(chóng)存在較大的差異（圖2）。經(jīng)過(guò)注釋分別屬于36個(gè)基因，其中PCGs 12個(gè)，分別是atp6、cob、cox1-3、nad1-6和nad4L，無(wú)atp8基因；編碼線粒體核糖體RNA的2個(gè)rRNA（rrnS和rrnL）和22個(gè)tRNA基因。非編碼區(qū)位于nad4與cox1基因間，該部分未能通過(guò)測(cè)序片段完成組裝。采用結(jié)合非編碼區(qū)兩側(cè)區(qū)域的引物AM_F與AM_R進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)獲得的片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示非編碼區(qū)長(zhǎng)度約1 600 bp，顯著少于貝西滑刃線蟲(chóng)的3 142 bp。通過(guò)Sanger測(cè)序獲得其中1 393 bp序列，其余部分由于存在大量AT串聯(lián)重復(fù)，測(cè)序未能成功。對(duì)獲得的非編碼區(qū)進(jìn)行分析顯示，除AT短重復(fù)外，該區(qū)域至少存在9個(gè)103 bp的串聯(lián)重復(fù)。將Sanger測(cè)序獲得的非編碼區(qū)與高通量測(cè)序的組裝結(jié)果進(jìn)行拼接，共獲得14 411 bp的苜蓿滑刃線蟲(chóng)基因組，堿基A、T、C、G的含量分別為23.7%、55.9%、10.2%、10.2%，存在明顯的AT 偏好性。

圖2 墊刃亞目不同線蟲(chóng)種群的線粒體基因排列順序Fig.2 Mitochondrial gene arrangement among different species in suborder Tylenchina

2.3 苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組的rRNA基因和tRNA基因結(jié)構(gòu)

苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組中rrnS基因長(zhǎng)度為910 bp，位于trnH和nad3基因間；rrnL基因長(zhǎng)度為667 bp，位于trnE與trnS2之間，兩者AT含量分別為84.9%和83.2%。MUSCEL序列比對(duì)顯示，苜蓿滑刃線蟲(chóng)的rRNA與貝西滑刃線蟲(chóng)的rrnL和rrnS的相似度最高，分別為72.1%和77.2%。對(duì)苜蓿滑刃線蟲(chóng)基因組進(jìn)行同源性比對(duì)分析，預(yù)測(cè)得到了22個(gè)tRNA基因的序列，有關(guān)tRNA基因的位置見(jiàn)表1。22個(gè)tRNA基因的長(zhǎng)度在53-57 bp 范圍之間，其中最長(zhǎng)的為trnK，最短的為trnS1。

表1 苜蓿滑刃線蟲(chóng)的線粒體基因位置分布與起始終止密碼子Table 1 Placements and start/stop codons of mitochondrial genes in A. medicagus

對(duì)tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示，得到的tRNA基因大部分均無(wú)法折疊形成典型的后生動(dòng)物的三葉草結(jié)構(gòu)，只有trnI基因序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)能折疊成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，其余21個(gè)tRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為非典型（圖3）。這些非典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)均屬于可變莖（variable arm）及配對(duì)臂缺失，呈TV-loop 結(jié)構(gòu)。

圖3 苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted secondary structure of tRNA in the mitochondrial genome of A. medicagus

2.4 苜蓿滑刃線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育分析

將12個(gè)PCGs（atp6、cob、cox1-3、nad1-6和nad4）基因分別轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，聯(lián)合構(gòu)建了包含3 948個(gè)信息位點(diǎn)的序列矩陣。采用極大似然法構(gòu)建了包括線蟲(chóng)門(mén)兩個(gè)亞目20個(gè)科共30種線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），從圖中可以看出，苜蓿滑刃線蟲(chóng)與貝西滑刃線蟲(chóng)互為姐妹群，且獲得高度支持（BS=100），且與松材線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)處在高度支持（BS=100）的滑刃線蟲(chóng)科（Aphelenchoididae）單系中。燕麥真滑刃線蟲(chóng)與滑刃科線蟲(chóng)的親緣關(guān)系雖然較遠(yuǎn)，但還是以較高的支持率與小桿亞目（Rhabditina）、旋尾亞目（Spirurina）、滑刃線蟲(chóng)科、斯氏線蟲(chóng)科（Steinernematidae）以及全凹線蟲(chóng)科（Panagrolaimidae）的部分種類(lèi)聚類(lèi)在一個(gè)大分支中（BS=97）。以短體線蟲(chóng)科（Pratylenchidae）、異皮線蟲(chóng)科（Heteroderidae）與根結(jié)線蟲(chóng)科（Meloidogynidae）為代表的墊刃類(lèi)線蟲(chóng)與寄生脊椎動(dòng)物的盤(pán)尾絲蟲(chóng)科（Onchocercidae）互為姐妹群，但拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)支持率較低（BS=53），且兩者構(gòu)成的分支在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的地位尚無(wú)法解析（BS=29）。

圖4 基于12個(gè)蛋白編碼基因的氨基酸序列構(gòu)建的極大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences from concatenated 12 protein coding genes by maximum likelihood method

3 討論

線粒體基因組信息在物種多樣性與系統(tǒng)發(fā)育研究上有著廣泛的應(yīng)用前景，但因傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增測(cè)序方法效率低，成本較高，目前僅有105個(gè)物種完成了線粒體基因組測(cè)序。相比超過(guò)25 000種已描述的線蟲(chóng)［29］，大多數(shù)線蟲(chóng)的線粒體基因信息仍然未知。已有研究顯示，線蟲(chóng)的線粒體基因結(jié)構(gòu)為一個(gè)雙鏈閉合的單環(huán)或雙環(huán)［10］，大小在12-22 kb，一般包括36個(gè)基因，即編碼氧化磷酸化所需酶的12個(gè)蛋白編碼基因（PCGs），分別是atp6、cob、cox1-3、nad1-6和nad4L，編碼線粒體核糖體RNA組分的2個(gè)rRNA（rrnS和rrnL），以及翻譯不同線粒體蛋白的22個(gè)tRNA。目前已知只有寄生脊椎動(dòng)物的旋毛屬（Trichinellaspp.）和鞭蟲(chóng)屬（Trichurisspp.）包含atp8基因，而大多數(shù)線蟲(chóng)缺少atp8基因［12］。本研究共獲得14 411 bp的苜蓿滑刃線粒體基因組序列，另有約1 600 bp序列因存在大量AT串聯(lián)重復(fù)，測(cè)序未能成功。對(duì)基因組成分析顯示，苜蓿滑刃線蟲(chóng)的線粒體基因組與其他大多數(shù)線蟲(chóng)較為相似，具有除atp8外的36個(gè)基因；在基因排列與組成上，與貝西滑刃線蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)這3種滑刃科線蟲(chóng)的基因排序結(jié)構(gòu)完全相同且序列相似度最高，而與燕麥真滑刃線蟲(chóng)以及傷殘短體線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)等墊刃類(lèi)線蟲(chóng)存在較大差異，顯示滑刃線蟲(chóng)科與真滑刃線蟲(chóng)科以及其他墊刃類(lèi)線蟲(chóng)均存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，這與前期線粒體基因組系統(tǒng)發(fā)育研究［8，13］與核糖體RNA系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致，支持滑刃科線蟲(chóng)與墊刃類(lèi)線蟲(chóng)分別有著獨(dú)立的進(jìn)化起源［30］。

對(duì)tRNA的比較分析顯示，苜蓿滑刃線蟲(chóng)與貝西滑刃線蟲(chóng)［11］最為相似，兩者具有相似的基因長(zhǎng)度（分別為53-57 bp與51-59 bp），比哥倫比亞紐帶線蟲(chóng)的基因長(zhǎng)度變化范圍（52-72 bp）更窄。苜蓿滑刃線蟲(chóng)tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中有一個(gè)為典型的三葉草結(jié)構(gòu)（rrnI），其余均為可變莖及配對(duì)臂缺失，貝西滑刃線蟲(chóng)tRNA也均為可變莖及配對(duì)臂全部缺失，兩者較為相近，而哥倫比亞紐帶線蟲(chóng)中有7個(gè)tRNA具三葉草結(jié)構(gòu)［16］，明顯多于苜蓿滑刃與貝西滑刃線蟲(chóng)線蟲(chóng)，因此二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣支持滑刃科線蟲(chóng)具有更為相近的親緣關(guān)系，而與墊刃類(lèi)線蟲(chóng)存在一定差異。

本研究中測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)大部分為細(xì)胞核基因，僅有0.68%屬于線粒體基因，這與昆蟲(chóng)中0.5%-1.4%的比例類(lèi)似［31-32］，但是明顯高于哥倫比亞紐帶線蟲(chóng)的0.2%線粒體序列含量［16］。截至到 2021年初，部分測(cè)序公司的建庫(kù)費(fèi)用已降低至200-300元/文庫(kù)，單個(gè)樣品二代測(cè)序費(fèi)用亦低至50元/Gb。因此，隨著測(cè)序成本的降低，通過(guò)增加測(cè)序通量彌補(bǔ)線粒體數(shù)據(jù)含量低，進(jìn)而獲得充足的測(cè)序深度和組裝質(zhì)量的策略在實(shí)踐中成為可能。

本研究首次完成了苜蓿滑刃線蟲(chóng)的線粒體基因測(cè)序，結(jié)果顯示，低覆蓋全基因組測(cè)序法可以成功組裝出線粒體基因組中大部分序列，證明了利用該方法獲取線蟲(chóng)線粒體全基因組序列的可行性。同時(shí)，線粒體基因組與傳統(tǒng)的核糖體RNA相比擁有更多的信息位點(diǎn)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也具有更高的支持率，因此低覆蓋全基因組測(cè)序法在線蟲(chóng)線粒體基因組研究上將有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過(guò)低覆蓋全基因組測(cè)序法獲得了苜蓿滑刃線蟲(chóng)線粒體基因組，研究表明其基因的構(gòu)成排列與貝西滑刃線蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)及擬松材線蟲(chóng)相同，系統(tǒng)發(fā)育地位相近。本研究證明了低覆蓋全基因組測(cè)序法獲取線蟲(chóng)線粒體全基因組序列的可行性。