大豆孢囊線蟲生防菌株Myrothecium verrucaria ZW-2發酵條件優化及活性物質分析

陳倩 張露源 陳伯昌 吳海燕

（廣西農業環境與農產品安全重點實驗室 廣西大學農學院，南寧 530004）

大豆是全球糧食安全的重要作物，每年因大豆病害造成了嚴重損失，其中大豆孢囊線蟲?。⊿CN，Soybean cyst nematode，Heterodera glycines）是 危 害大豆最嚴重的病原之一［1-2］，在世界上各大豆產區均有發生，中國、美國、加拿大、巴西、阿根廷、俄羅斯等大豆生產國廣泛發生，每年造成大豆減產10%左右［3］，給世界大豆造成的產量損失在900萬t以上，在中國，截止到2015年共有23個?。ㄊ?自治區）相繼發現大豆孢囊線蟲［4］，使大豆產量大大降低，影響豆類作物生產安全［5］。

目前，防治植物線蟲病害仍以化學防治為主，但隨之也帶了許多問題，如環境污染、抗藥性問題等，許多高毒高殘留的化學殺線蟲劑如溴甲烷［6-7］、呋喃丹［8］等已被禁用。隨著人們環保意識逐步提高，尋求低毒、低殘留、對環境友好的生物制劑越來越受到關注，并成為防治植物線蟲病害的關注熱點。近年，菲律賓、中國、美國、南非、印度、加拿大等國登記注冊了以淡紫擬青霉為活性成分的菌劑來防治植物線蟲［9］。淡紫擬青霉菌和蓖麻油防治獼猴桃幼苗的根結線蟲病，防治效果分別在55%和73.61%以上，防效良好［10］。芽孢桿菌Sneb207可降低大豆孢囊線蟲孢囊、幼蟲以及卵的數量，還可促進大豆植株的生長［11］；芽胞桿菌BL-21與HNDF2的混合菌液對大豆孢囊線蟲孢囊孵化的相對抑制率達到了80.93%，對2齡幼蟲（J2）的校正死亡率也達到91.08%［12］。研究報道疣孢漆斑菌的發酵產物二萜化合物實現了商業化［13］，廣泛應用于高價值水果、蔬菜和觀賞作物，對根結線蟲、禾谷類孢囊線蟲、短體線蟲等十余種線蟲有防效［14］；疣孢漆斑菌麥芽提取物液體可有效減少番茄根部根結數以及土壤中根結線蟲的數量［15］；然而，我國該方面的研究進展較慢，僅報道菌株X-16可有效控制北方根結線蟲群體［16］。本研究在明確疣孢漆斑菌ZW-2菌株發酵液對大豆孢囊線蟲有毒殺作用的基礎上［17］，通過篩選菌株活性物質產生的最佳發酵溫度、轉速、裝瓶量、pH以及培養基的最佳營養物質，確定其產生殺線蟲活性代謝產物的最優培養條件，并且利用代謝組分析ZW-2菌株代謝物質中的活性成分，為開發和應用M. verrucariaZW-2菌株的殺線蟲功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 ZW-2菌株學名為Myrothecium verrucaria，GenBank登錄號KR708633。保存在中國菌種保藏中心（登記號CCTCC NO：M 2015522）。

1.1.2 供試線蟲 供試線蟲為大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines，4號生理小種），收集接種大豆孢囊線蟲后35 d后的大豆植株（品種為魯豆4號）根系上新鮮孢囊，用70%酒精消毒3 min，無菌水沖洗4次，在立體顯微鏡下，用玻璃棒將300目孵化篩中的孢囊碾碎分解，加少許滅菌水，得到卵懸浮液。將孵化篩置于25℃的智能光照培養箱中避光孵化，收集新鮮的J2用于當天的試驗。

1.2 方法

1.2.1 基礎發酵液制備 25℃恒溫條件下，菌株ZW-2在PDA平板（直徑為9 cm）培養5 d后，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌塊，將菌塊轉接至裝有100 mL Czapek培養液（NaNO32.00 g，KCl 0.50 g，FeSO40.01 g，K2HPO41.00 g，MgSO40.50 g，蔗糖30.0 g，H2O 1 000 mL）的250 mL錐形瓶中，置于28℃、160 r/min的恒溫搖床培養14 d，發酵液通過0.45 μm濾膜過濾獲得發酵濾液。

1.2.2 發酵液殺蟲活性檢測 在96孔板中，每孔中大豆孢囊線蟲J2（24 h內收集的）約50條左右，并加入200 μL菌株ZW-2發酵濾液，以滅菌蒸餾水為對照（由于前期預實驗結果表明培養基和滅菌水對大豆孢囊線蟲無顯著影響［17］，故本研究僅設滅菌水為對照），每個處理設置4個重復，將96孔板置于25℃的恒溫培養箱中，每隔6、12、24、48、72 h在顯微鏡下觀察記錄線蟲的死亡數量，并計算出死亡率。線蟲死亡判定標準：線蟲僵直，且用毛針刺激后不活動，確定線蟲死亡。

死亡率=（死亡J2總數/處理J2總數）×100%

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%

1.2.3 發酵溫度、搖床轉速、培養基pH以及裝瓶量對發酵液殺蟲活性的影響 為了篩選出菌株ZW-2的最佳發酵條件，以發酵溫度、發酵轉速、培養基pH以及裝瓶量作為4個因素，設置發酵溫度（A1=26℃、A2=28℃、A3=30℃）、發酵轉速（B1=140 r/min、B2=160 r/min、B3=180 r/min）、培養基pH（C1=6、C2=7、C3=8）以及裝瓶量（D1=75 mL、D2=100 mL、D3=125 mL）進行4因素3水平的正交設計實驗，然后按照1.2.2的方法培養：培養菌株1周（前期試驗表明培養菌株1周、2周、3周發酵濾液對大豆孢囊線蟲死亡率無顯著差異，故選用發酵1周進行試驗）后，發酵液稀釋5倍［17］，0.45 μm過濾器過濾，通過測定對大豆孢囊的毒殺作用，篩選最優組合后做碳氮源的優化。評價標準：菌株ZW-2發酵濾液處理大豆孢囊線蟲72 h的死亡率。

1.2.4 營養條件優化 碳源篩選：用葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉3種碳源替代基礎發酵液培養基（Czapek培養基）中的蔗糖作為碳源，其他成分不變。發酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉速為180 r/min。培養菌株1周后，發酵液稀釋5倍，0.45 μm過濾器過濾，通過測定殺線活性試驗，方法同1.2.2，滅菌水為對照。進行3次重復試驗。

氮源篩選：用氯化銨、牛肉膏和硫酸銨這3種氮源替代基礎發酵培養基（Czapek培養基）中的硝酸鈉作為氮源，其它成分保持不變。發酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉速為180 r/min。培養菌株1周后，發酵液稀釋5倍，0.45 μm過濾器過濾，測定殺線活性方法同1.2.2，滅菌水為對照。進行3次重復試驗。篩選出最佳碳源，最后根據單因素試驗結果篩選出最佳碳源和氮源。

正交設計實驗：根據單因素實驗篩選出的最佳碳源A（A1=20 g、A2=25 g、A3=30 g、A4=35 g、A5=40 g）和氮源B（B1=1.0 g、B2=1.5 g、B3=2.0 g、B4=2.5 g、B5=3.0 g）進行2因素5水平的正交設計實驗。發酵方法同1.2.1，搖床溫度28℃，轉速為180 r/min。培養1周后取出，將發酵液稀釋5倍，用0.45 μm過濾器過濾后，進行殺線活性測定，方法同1.2.2，以滅菌水為對照。此試驗重復3次。

1.2.5 ZW-2菌株發酵液的代謝產物殺線蟲活性成分研究 將1.2.1得到的8 L菌株ZW-2液體發酵液濾液過濾后旋蒸濃縮至500 mL，由正丁醇萃取的粗提產物經甲醇凝膠柱層析分離收集得到不同的流分，每隔2 min收集一次洗脫液。洗脫液各極性組分可通過薄層色譜法（TCL）分析檢測，經顯色的斑點不同指引合并，純化后篩選殺線蟲效果最好的流分進行化合物代謝組學分析。

應用超高效液相-質譜聯用儀對大豆孢囊線蟲72 h死亡率達到了80%以上的流分加以處理進行代謝物質鑒定。色譜條件為流動相A相為水和0.1%甲酸溶液，流動相B相為甲醇溶液，進樣量2 μL，洗脫條件為：0-10.00 min，90.0% A（V∶V，下同），10.0% B；10.00-12 .00 min，5.0%A，95.0%B；12.10-15.00 min，90.0%A，10.0%B。質譜掃描模式為MSECentroid，正、負離子。離子源為ESI。質量掃描范圍：100-1 200 Da。毛細血管電壓設置為3 Kv，離子源溫度設置為100℃，脫溶劑氣體溫度設置為450℃，氣體流速設置為650 L/h，錐孔氣體流量設置為50 L/h。

1.2.6 數據統計與分析 用SPSS 19.0進行試驗數據的方差分析，根據Duncan’s新復極差法檢驗P＜ 0.05水平下的差異顯著性，用Sigmaplot10.0作圖。

根據多元統計分析（PLS-DA）結果得到的變量權重值選擇差異變量。通過UNIFI Protal軟件分析，ProgenesisQI作圖，之后通過代謝物數據庫（KEGG、PlantCyc等）確認差異物及其結構式。

2 結果

2.1 菌株ZW-2殺線蟲活性發酵液條件優化分析

2.1.1 發酵溫度、搖床轉速、培養基pH以及裝瓶量對發酵液殺蟲活性的影響 試驗結果表明，對ZW-2菌株發酵液殺線效果影響的重要因素依次為因素B（搖床轉速）、因素A（發酵溫度）、因素D（裝瓶量）和因素C（培養基pH）。并且當搖床轉速為180 r/min，發酵溫度為28℃，裝瓶量為100 mL，培養基pH為8（表1）時，殺線效果最好，為菌株ZW-2發酵液的最佳發酵條件。

表1 不同發酵溫度、搖床轉速、培養基pH和裝瓶量的ZW-2菌株發酵液處理大豆孢囊線蟲J2校正死亡率Table 1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with ZW-2 strain fermentation broth under different fermentation temperature，shaking speed，medium pH and bottle volume

2.1.2 菌株ZW-2發酵液碳源和氮源種類殺線蟲活性優化 菌株ZW-2在不同成分碳源條件的Czapek培養基中發酵1周5倍稀釋濾液處理大豆孢囊線蟲SCN毒殺效果顯著（P＜0.05），均隨時間的增加死亡率逐漸升高，72 h后大豆孢囊線蟲的死亡率達到了87.00%以上。72 h菌株ZW-2的發酵液處理大豆孢囊線蟲J2后，死亡率最高的處理是以蔗糖以及淀粉作為培養基碳源，死亡率分別為96.29%和93.35%，殺線效果顯著高于其他處理及滅菌水對照（P＜ 0.05）（圖1）。

圖1 菌株ZW-2在不同碳源培養基中發酵1周的5倍稀釋發酵液處理大豆孢囊線蟲J2校正死亡率Fig.1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different carbon source medium for 1 week

菌株ZW-2在不同氮源條件的Czapek培養基中發酵1周，培養菌株ZW-2獲得的5倍稀釋濾液對大豆孢囊線蟲J2毒殺效果顯著（P＜0.05）（圖2），當以硝酸鈉、硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨作為培養基的氮源時，死亡率隨時間的增加而增加。當氮源為氯化銨時，處理72 h發酵濾液對大豆孢囊線蟲J2的毒殺效果低于處理48 h，此時存在部分線蟲活動能力恢復的現象。當氮源為硝酸鈉、牛肉膏和蛋白胨時，72 h發酵濾液對大豆孢囊線蟲J2 的毒殺效果最好，死亡率分別為96.29%、88.01%和91.36%，并且與對照組相比，死亡率明顯升高，差異效果顯著（P ＜0.05）。但由于經濟效益的影響，最終選擇蔗糖以及硝酸鈉作為培養基的最佳碳源以及最佳氮源。

圖2 菌株ZW-2在不同氮源培養基中發酵1周的5倍稀釋發酵液處理大豆孢囊線蟲J2校正死亡率Fig.2 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different nitrogen source medium for 1 week

2.2 菌株ZW-2發酵液代謝產物殺線蟲活性成分研究

發酵液旋蒸萃取洗脫后，洗脫液根據TLC檢測和紫外分析檢測的斑點合并后得到的組分，經檢測后對大豆孢囊線蟲具有毒殺作用，72 h后線蟲死亡率達到了87.65%，與對照組相比，毒殺效果顯著。

利用UPLC-Q-TOF對ZW-2菌株發酵液流分以及溶于甲醇的Czapek培養基進行對照檢測，對主要的差異性物質通過PCA和PLS-DA法進行多元統計分析，分析組間的差異性以及組內的重復穩定性，再通過數據庫進行人工對比，對檢測中的可能性的差異性物質進行推測。

由圖3可知，對照組和流分分布在不同的區間，兩者之間差異顯著，分離趨勢比較明顯，同一處理能夠近距離聚焦，能較好地區分流分與對照，這初步說明數據有效可信。我們可以進一步采用PLS-DA法差異性代謝物進行判別檢測。由PLS-DA模型的變量重要性投影值（VIP）值的各代謝物積累差異的影響強度以及解釋能力，綜合顯著性檢驗結果，對潛在的差異性代謝物進行分析，準確的反映標志性代謝物信息。

圖3 ZW-2菌株液體發酵液流分正離子（A）和負離子（B）PCA散點圖Fig. 3 PCA score plot of positive（A）and negative（B）ions in the fermentation broth of strain ZW-2

由PLS-DA結果及獲得的多變量分析模型的變量重要性投影值（VIP）初步篩選出差異代謝物，得到4 393個物質數據矩陣，以碎片正負離子得分以及發酵液活性物質性質以及物質功能，篩選出具有發酵液活性成分的20個物質。

同時通過檢測出的正負離子特征經分析在ChemSpider數據庫中對比可得，篩選出物質為脂肪族化合物，如脂肪酸脂類、醇與多元醇、醚類、酯類化合物等。標志性差異物質可能是磷酸三（丁氧基乙基）酯，NP-40（乙基苯基聚乙二醇）、六聚乙二醇單十二醚、氟氯菊酯、verrucarin A、roridin A、verruculogen、三月桂胺等（表2）。

表2 標志性差異物中可能發酵液活性物質列表Table 2 List of possible fermentation broth active substances in differences iconic objects

3 討論

近年來利用微生物的代謝產物來防治病害越來越受到人們的關注，篩選出生長速率快、產孢量高、安全高效的菌株具有重要意義以及應用價值［18］。本試驗所選用的疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria），抑菌譜較廣［19］，抑菌活性較強［20-21］，可用于防治植物寄生線蟲［22］，同時對野葛、馬齒莧、長芒莧等雜草具有生物除草活性［23］。因此，疣孢漆斑菌的代謝產物具有重要的應用價值。

代謝產物的產量顯著影響了生防菌的生防效用。發酵的溫度、轉速、pH、裝瓶量及培養基的碳源氮源等都影響菌株的生長以及代謝產物的活性［24-25］。人們可通過優化生防菌發酵液培養條件，促進菌體生長以及提高菌株的防效［26］，促進毒殺根結線蟲J2活性物質的產生［27］。拮抗根結線蟲的微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavus以燕麥片為碳源、酵母粉為氮源，培養溫度25℃，搖床轉速210 r/min，培養4 d，起始pH 7，裝液量75 mL時毒殺線蟲活性達93.29%，提高了8.93個百分點［28］。微白黃鏈霉菌 G-1發酵液在8% 麥芽糖、馬鈴薯 16.5%、pH 6.5、溫度 30℃、轉速 160 r/min、發酵 5 d的條件下抗真菌活性提高，抗菌物質增加［29］。粉紅螺旋聚孢屬NF-06固體發酵液培養條件pH為7，含水量40%，接種量5%時，產孢量增加，南方根結線蟲數量以及番茄根結數有效降低［30］；芽孢桿菌SMrs在發酵48 h，溫度28℃，轉速180 r/min，裝液量30 mL，初始pH 7.2時，殺線蟲活性明顯提高［31］。

代謝組學（metabolomics）是對生物代謝物質的分析［32］，可用于疾病診斷藥物鑒定、植物代謝以及抗逆響應機制等［33］。本研究通過對M. verrucariaZW-2菌株發酵液進行代謝組分析，在試驗中經代謝組分析得到Verrucarin A、Roridin A等20種可能與殺蟲殺線蟲有關的標志物。羌活體內生菌疣孢漆斑菌的發酵液中分離純化得到了Verrucarin B、8-acetoxyroridin H、Verrucarin M、Verrucarin J、Roridin D、Verrucarin L acetate、Isororidin E、Oridin E、Roridin H、Roridin A、Roridin E acetate、Isotrichoverrin A、Isotrichoverrin B、Verrucarin A等14種化合物，在1 000 ppm濃度下除Isotrichoverrin A均具有良好的殺蟲活性，對綠棉鈴蟲致死率在70%以上［21］；從土壤分離的漆斑菌Myrotheciumsp. KX136897液體發酵后純化鑒定出Verrucarins A、Roridin D、Roridin A、Verrucarin J、Roridin A、Verrucarin B等，其 中Roridin D對 大 腸 桿 菌有弱抑菌活性、Roridin A對蠟狀芽孢桿菌和鰻弧菌也具有抑菌活性［34］；Nguyen等［15］從疣孢漆斑菌KACC40321菌株的丙酮提取物中分離得到Verrucarin A和Roridin A具有殺南方根結線蟲J2的活性；Murakami等［35］從來自土壤的Myrothecium verrucaria中分離得到Roridin L、Roridin M、Verrucarin M；將疣孢漆斑菌IT6菌株接種在菠菜上可產生Verrucarin A and Roridin E［36］；本研究通過代謝組分析發現ZW-2菌株發酵液中有多種與殺蟲相關的物質，其中Verruculogen，是一種過氧化物的生物堿［37］；氟氯菊酯（聯苯菊酯）是一種擬除蟲菊酯類［38］，可防治小麥蚜蟲［39］、白蟻［40］等農田害蟲；三月桂胺可用作萃取劑負載液膜去除工業廢水中的砷［41］。但Verruculogen、氟氯菊酯、三月桂胺等物質是否具有殺線蟲功能有待進一步驗證。另外，董海龍等［22］從疣孢漆斑菌X-16代謝產物中分離出了 3-異丁基六氫吡咯并［1，2-a］吡嗪-1，4-二酮和乙酸丁酯，對根結線蟲J2有較好的毒殺活性。但本研究中未檢測到該物質，原因可能是分離提取方法不同。因此，本研究的疣孢漆斑菌ZW-2菌株代謝組中標志性差異物，為深入研發該生防菌株提了供理論依據。

4 結論

在前期研究基礎上進一步優化菌株ZW-2發酵液毒殺大豆孢囊線蟲活性的培養條件，最優條件為：以Czapek培養基為基礎培養基，最佳培養溫度為28℃，搖床轉速為180 r/min，裝瓶量為100 mL，培養基pH為8，以蔗糖和硝酸鈉為碳源和氮源。通過代謝組學分析，共篩選出20種差異代謝物，包括酰胺類化合物和脂肪族化合物，這些差異代謝物可能是疣孢漆斑菌具有殺線蟲活性的標志物，研究結果可為進一步探索疣孢漆斑菌ZW-2菌株發酵生產以及精深加工提供參考依據。