堿水解法測定乳脂肪方法的改良應用

楊愛君，羅少杰，曹學思，紀坤發(fā)，童 駿

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510700

0 引言

乳脂肪是乳制品重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是乳制品質(zhì)量的主要理化指標之一；牛乳脂肪的檢測一直以來是常規(guī)檢測的重要項目。目前《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[1]中第三法堿水解法和第四法蓋勃法均適用于乳制品、嬰幼兒配方食品中脂肪的測定。在乳制品脂肪測定的過程中，由于酪蛋白鈣鹽吸附了大部分的游離脂肪，難以直接使用溶劑萃取，所以需要先用氨水溶解酪蛋白鈣鹽，進而在堿性條件下使乳脂肪游離[2]。由此可見，堿水解法更適用于乳制品脂肪含量的測定。作為乳制品脂肪含量測定的仲裁方法[3]，堿水解法具有穩(wěn)定、準確等優(yōu)點[4]，但其檢測時間長，消耗試劑多，成本相對較高[5]。

本文主要探討《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第三法堿水解法的改良應用，在堿水解法測定過程中，對抽提、蒸干、稱量等步驟進行簡化操作，減少試劑消耗，提高檢測效率。為了證實本方法的檢測結(jié)果準確可靠，根據(jù)《GB/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[6]的要求對該方法的精密度和準確度進行了驗證。同時參加了乳脂肪的能力驗證，證明改良后的檢驗方法可以應用到日常的檢測中。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

ML204型分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司），感量0.0001 g；DHG-9023A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-1型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（國化電器有限公司）；100 mL具塞量筒；多用途離心機（德國FUNKE GERBER公司）；抽脂瓶。

1.2 試驗試劑

氨水（廣州化學試劑廠，分析純）；無水乙醇（廣州化學試劑廠，分析純）；剛果紅（上海遠航試劑廠，分析純）；乙醚（廣州化學試劑廠，分析純）；石油醚（廣州化學試劑廠，分析純）。

1.3 試驗方法

1.3.1 方法原理

用無水乙醚和石油醚抽提樣品的堿（氨水）水解液，通過蒸發(fā)去除溶劑，測定溶于溶劑中抽提物的質(zhì)量[1]。

1.3.2 試驗步驟

《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》堿水解法和改良法的詳細試驗步驟見圖1。

圖1 試驗步驟

1.4 計算公式

1.4.1 國標法試樣中脂肪含量按公式（1）計算

式中：X為試樣中脂肪含量，單位為克每百克（g/100g）；m1為恒重后脂肪收集瓶和脂肪的質(zhì)量，單位為克（g）；m2為脂肪收集瓶的質(zhì)量，單位為克（g）；m3為空白試驗中，恒重后脂肪收集瓶和抽提物的質(zhì)量，單位為克（g）；m4為空白試驗中脂肪收集瓶的質(zhì)量，單位為克（g）；m為樣品的質(zhì)量，單位為克（g）；100為換算系數(shù)。

1.4.2 改良法試樣中脂肪含量按公式（2）計算

式中：

X ——為試樣中脂肪含量，單位為克每百克（g/100g）；

W ——為試樣的重量，單位為克（g）；

W1——為燒杯的重量，單位為克（g）；

W2——為燒杯加脂肪的重量，單位為克（g）；

V0——為醚層總體積，單位為毫升（mL）；

V1——為移取醚層的體積，單位為毫升（mL）；

100 ——為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良法的優(yōu)點

2.1.1 抽提

《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中第三法堿水解法抽提時使用抽脂瓶，抽提后用傾倒的方法將抽脂瓶內(nèi)提取物轉(zhuǎn)移至脂肪收集瓶內(nèi)。實際操作中每次使用混合試劑清洗后，瓶頸內(nèi)壁上仍不可避免殘留提取物，同時，此操作需在完整保留水層的情況下，將醚層全部倒出，因此，對試驗人員的要求較高。

改良后使用具塞量筒替代抽脂瓶，抽提后可以直接讀取醚層的體積，再用移液管精確移取一定體積的醚層，避免了未知的殘留，移取量更加準確，操作也更加簡便。

2.1.2 蒸干

在蒸干步驟中，改良法采用燒杯替代了《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中第三法堿水解法的脂肪收集瓶，通過增大容器口徑，加快有機溶劑的揮發(fā)速度，縮短試驗時間，提高檢測效率。

2.1.3 稱量

《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中第三法堿水解法國標法通過將醚層全部倒出后蒸干、恒重得到試樣中脂肪的含量，但無法避免有部分醚層殘留在瓶內(nèi)，從而影響檢測結(jié)果。改良方法使用了脂肪的體積比換算得到試樣中脂肪的含量，能準確讀取脂肪的總體積和移取量，結(jié)果更具有可信度。

2.2 精密度試驗

選擇了7 個濃度梯度的樣品，每個樣品均使用《GB 5009.6—2016食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第三法和改良方法分別測定6 次，代入公式得到脂肪含量的試驗數(shù)據(jù)，同時，計算本次試驗結(jié)果的變異系數(shù)和兩種方法試驗結(jié)果的差值D，見表1。

根據(jù)《GB/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F，當被測組分含量在1.00%～10.00%時，測試結(jié)果的變異系數(shù)＜2.00%；當被測組分含量在0.10%～1.00%時，測試結(jié)果的變異系數(shù)＜2.70%[6]。由表1可知，本次試驗結(jié)果的變異系數(shù)為0.26%～1.73%，說明該改良方法的精密度符合上述標準要求。

2.3 改良法與國標法的顯著性比較試驗

比較改良方法和《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第三法國標法對7 個樣品的測定結(jié)果，其差值D的絕對值均小于0.10 g/100 g，見表1。使用t檢驗法對改良法和國標法的測定結(jié)果進行顯著性比較，通過SPSS軟件計算得到t=0.082。查t分布表，當自由度n=6時，t0.05，6=2.447。結(jié)果顯示t＜t0.05，6，說明改良法和國標法的檢測結(jié)果無顯著性差異，即兩種方法的檢測結(jié)果一致，可使用改良方法替代《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準食品中脂肪的測定》第三法國標法進行乳及其制品的日常檢測[7，8]。

表1 重復性試驗結(jié)果（n=6）

2.4 準確度試驗

2019 年使用改良方法參加了華測檢測認證集團股份有限公司組織的奶粉中營養(yǎng)成分的測定能力驗證（編號：CTI-CF13125121），2020年使用改良方法參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心舉辦的奶粉中蛋白質(zhì)、脂肪的測定能力驗證（編號：ACA SPT972），均得到滿意結(jié)果，能力驗證具體結(jié)果見表2。

根據(jù)《GB/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，當被測組分含量＞10000 mg/kg時，測定值與真值的偏差范圍應＜5.00%[6]。由表2可知，準確度試驗結(jié)果的偏差為1.89%～3.90%，說明該改良方法的準確度符合上述標準要求。

表2 能力驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗的結(jié)果表明，①通過具塞量筒替代抽脂瓶；②用脂肪的體積比換算脂肪的質(zhì)量；③使用燒杯替代脂肪接收瓶，增大口徑使有機溶劑快速揮發(fā)，縮短試驗時間；④減少抽提次數(shù)，降低試劑損耗等四方面的改良。改良方法測定生牛乳、巴氏殺菌乳和發(fā)酵乳等乳及其制品的脂肪含量，在操作過程中具有抽提簡單化、節(jié)省檢測時間、檢測器具方便清洗等優(yōu)點。使用《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第三法國標法和改良方法重復測定7 個濃度梯度樣品，得到該方法的變異系數(shù)在0.26%～1.73%，并且差異顯著性分析表明該方法可替代《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第三法國標法。同時，該方法也連續(xù)兩年通過了能力驗證，且測定值與指定值的偏差為1.89%～3.90%。改良方法的精密度和準確度均符合《GB/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，說明該方法有較好的重復性、穩(wěn)定性和準確性。可見在日常檢驗中，利用該方法對乳及其制品的脂肪含量進行檢測，具有一定的應用價值。