SMC4在人食管癌組織中的表達及對食管癌細胞增殖、侵襲和轉移的作用機制研究

張 冉 石長林 茍小軍 何鴻晏（四川省巴中市中心醫院胸心外科，巴中636000）

食管癌（esophageal cancer，EC）作為全球范圍致命的惡性腫瘤，主要分為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）［1］。其中，ESCC是亞洲中部和東部最常見病理學類型，占所有病理學類型的90%。全球癌癥統計數據顯示，ESCC全球發病率持續升高，已成為嚴重公共衛生問題［2］。EC轉移和復發是預后差的主要原因之一，而EC細胞侵襲和遷移是促進EC轉移的關鍵［3］。因此，探究EC細胞侵襲遷移的作用機制對其后續治療具有重要意義。染色體結構維持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）是SMC核心成員，在有絲分裂過程染色體凝集和分離過程中起重要作用［4］。SMC4可參與各種非有絲分裂染色體功能發揮過程，如DNA修復、維持基因下調狀態［5］；SMC4在前列腺癌、結直腸癌及肝癌中呈異常高表達［6-8］，且與癌細胞侵襲遷移密切相關，而SMC4與EC的關系鮮有報道。本研究檢測SMC4在人EC組織中的表達，分析其與臨床病理學參數的關系，通過小分子干擾RNA（siRNA）特異性降低SMC4表達，觀察其對EC細胞侵襲和遷移的影響，進一步探討其可能的分子機制，為EC臨床治療提供新靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人EC組織標本及細胞來源 收集2018年5月至2019年4月我院手術切除的EC組織標本及其相應癌旁正常組織標本各114例，其中女性64例、男性50例，平均年齡（52.51±3.72）歲；＜50歲41例，≥50歲73例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期64例；病理組織學類型：鱗癌84例，腺癌30例；組織分化程度：低分化65例，中分化28例，高分化21例；淋巴結轉移74例，未轉移40例；腫瘤直徑：≥3 cm 79例，＜3 cm 35例；浸潤深度：未及漿膜層34例，突破漿膜層80例。入選標準：癌組織經病理學證實為EC且未合并其他腫瘤；癌旁組織距離腫瘤邊緣外2 cm以上且經病理學證實未發生癌變；患者術前未接受放化療及其他治療。制備組織石蠟切片備用。EC細胞株KYSE170和Eca-109購自中科院上海細胞研究所。

1.1.2 主要試劑SMC4即用型免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司；胰蛋白酶、RPIM1640細胞培養基購自美國Gibco公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；反轉錄試劑盒購自 美 國Sigma；KYSE170-siNC、KYSE170-siSMC4、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；青、鏈霉素購自華北制藥有限公司；總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體采購自英國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 細胞培養箱采購自上海三騰儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；細胞培養箱購自SANYO；生物安全柜購自Haier；高速離心機購自Thermo；Ti-U∕Ti-s倒置熒光顯微鏡購自Nikon。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色檢測組織切片中SMC4表達 將收集的EC組織及其相應癌旁正常組織樣本固定包埋并切片，常規脫蠟和水化后置于檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復，3%H2O2室溫下浸泡以阻斷內源性過氧化物酶，封閉，加入稀釋后的SMC4一抗4℃孵育過夜，次日復溫后PBS洗滌，加入稀釋后的HRP標記的驢抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min，PBS洗滌。加入適量DAB孵育5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡透明后干燥，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。結果判定標準：由2位經驗豐富的病理醫師對病理切片進行盲評，各切片隨機選取5個高倍視野，各視野隨機計數200個細胞，以細胞出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，根據染色強度及陽性細胞率綜合評分。染色強度記分依據：無著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽性細胞數記分：無陽性細胞記為0分，＜25%記為1分，25%～50%記為2分，51%～75%記為3分，＞75%記為4分。以上2項計分相加結果≥3分為陽性。

1.2.2 穩定干擾SMC4細胞系建立 對數生長期EC細胞株KYSE170、Eca-109分別消化后加入含10%胎牛血清的高糖培養基，均勻鋪至6孔板，37℃、5%CO2培養，待細胞融合至70%左右時換為無血清培養基待轉染，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書操作，分別將干擾質粒KYSE170-siSMC4及陰性對照KYSE170-siNC轉染至KYSE170細胞，將Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4轉染至Eca-109細胞，繼續培養48 h，將構建成功的穩定干擾細胞系分別記為KYSE170-siSMC4和KYSE170-siNC，Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4，同時設置KYSE170和Eca-109空白對照組。

1.2.3 MTT檢測KYSE170和Eca-109細胞增殖 消化KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細胞，調整細胞濃度，5×103個∕孔接種至96孔板，混勻，37℃、5%CO2培養，第2、3、4、5、6天分別加入MTT試劑20 μl，37℃避光孵育4 h，棄孔內液體，加入100 μl DMSO，37℃搖床快速振蕩15 min，充分溶解結晶物，酶標儀檢測490 nm處OD值，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 Transwell小室檢測KYSE170和Eca-109細胞侵襲KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細胞消化后，調整細胞濃度，5×103個∕小室分別加入Transwell小室上室，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，常規培養48 h，棉簽擦凈上室細胞，PBS清洗，結晶紫染色，常規制片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機觀察5個視野，記錄穿膜細胞數，實驗重復3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測KYSE170和Eca-109細胞遷移KYSE170、KYSE170-siSMC4及KYSE170-siNC、Eca-109、Eca-109-siNC和Eca-109-siSMC4細胞消化后，調整細胞密度為5×105個∕ml，取2 ml接種于6孔板，并在6孔板背面劃5條平行線，24 h后用200 μl槍頭在細胞中劃2條垂直于背面平行線的直線，PBS沖洗2次，加入2 ml無胎牛血清RPMI1640培養液，于0、24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞向劃痕中間遷移的距離并拍照，各組實驗設3個平行孔，實驗重復3次。

1.2.6 IFA檢測上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關分子N-cadherin表達KYSE170、KYSE170-siSMC4及陰性對照KYSE170-siNC細胞消化后，5×105個∕ml均勻鋪至6孔板，37℃、5%CO2靜置培養24 h，棄培養液，4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖 洗2遍，0.1%Triton100通 透15 min，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉30 min，分別加入適量封閉液稀釋的N-cadherin一抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗，加入稀釋后的熒光標記的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗，稀釋好的DAPI染細胞核，干燥，封片，共聚焦顯微鏡下觀察拍照，記錄陽性細胞數。

1.2.7 Western blot檢測KYSE170細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 收集各組細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定含量。制備蛋白樣品，配制SDSPAGE凝膠，電泳，轉膜，5%BSA封閉液室溫孵育2 h。分別加入適量封閉液稀釋的一抗，4℃孵育過夜，次日復溫，PBST洗滌，加入適量稀釋好的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h，PBST洗滌，ECL避光5 min，暗室曝光并拍照，以GAPDH為內參。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立t檢驗，計數資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Graphpad5.01軟件作圖，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SMC4在EC組織和癌旁正常組織中的表達SMC4在EC組織中的陽性表達率（83.33%）高于顯著癌旁組織（10.53%，P＜0.001）。

2.2 SMC4在EC不同臨床病理分組中的表達SMC4表達與腫瘤直徑、TNM臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移及組織分化程度密切相關（P＜0.05），與EC患者年齡、性別無關（P＞0.05，表1）。

表1 SMC4在EC不同臨床病理分組中的表達（例）Tab.1 Expression of SMC4 in different clinicopathologi?cal groups of esophageal cancer（n）

2.3 穩定下調SMC4表達細胞系構建Western blot結果顯示，KYSE170-siSMC4組SMC4表達明顯低 于Control組 和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖1A），Eca-109-siSMC4組SMC4表達明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖1B），提示SMC4下調細胞株構建成功。

圖1 Western blot檢測KYSE170和Eca-109細 胞 中SMC4表達Fig.1 Western blot detection of SMC4 expression in KYSE170 and Eca-109 cells

2.4 SMC4對KYSE170和Eca-109細胞 增殖的 影響MTT結果顯示，與Control組和KYSE170-siNC組相比，KYSE170-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯下降（P＜0.05，圖2A），Eca-109-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖2B）。提示下調SMC4表達可明顯抑制KYSE170和Eca-109細胞增殖。

2.5 SMC4對KYSE170和Eca-109細 胞侵襲 的影響KYSE170-siSMC4組穿膜細胞數顯著少于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖3A），Eca-109-siSMC4組穿膜細胞數明顯少于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖3B），提示下調SMC4表達可明顯抑制KYSE170和Eca-109細胞侵襲。

圖3 SMC4對KYSE170和Eca-109細 胞 遷 移 的 影 響（×200）Fig.3 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells（×200）

2.6 SMC4對KYSE170和Eca-109細胞 遷移的 影響KYSE170-siSMC4組細胞遷移能力減弱，創傷愈合速率減慢，覆蓋劃痕區域少于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05，圖4A），Eca-109-siSMC4組覆蓋劃痕區域明顯少于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05，圖4B）。提示下調SMC4表達可抑制細胞遷移。

圖4 SMC4對KYSE170和Eca-109細胞遷移的影響Fig.4 Effect of SMC4 on cell migration of KYSE170 and Eca-109 cells

2.7 SMC4對EMT相關分子N-cadherin表達的影響 共聚焦顯微鏡觀察發現，下調SMC4表達，與Control組和KY SE170-siNC相比，KYSE170-siSMC4細胞中N-cadherin表達明顯下降（P＜0.05）。提示SMC4可促進N-cadherin表達（圖5）。

圖5 SMC4對EMT相關分子N-cadherin表達的影響（×100）Fig.5 Effect of SMC4 on expression of EMT related mole?cule N-cadherin（×100）

2.8 SMC4對細胞PI3K∕Akt信號通路關鍵蛋白表達的影響KYSE170-siSMC4組p-PI3K和p-Akt表達 明 顯 低 于Control組 和KYSE170-siNC組（P＜0.05），3組PI3K和Akt表達差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 SMC4對KYSE170細胞PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達的影響Fig.6 Effect of SMC4 on expressions of key proteins of PI3K/Akt signaling pathway in KYSE170 cells

3 討論

EC是全球高發惡性腫瘤之一，我國EC發病率位居全球第五，死亡率位居第四，且呈不斷上升趨勢［9］。分子靶向治療是繼手術治療、放化療的腫瘤治療策略，可增強腫瘤抑制基因表達，抑制腫瘤細胞增殖和轉移，已成為國內外腫瘤研究領域熱點。EC是常見消化道腫瘤，包括鱗癌與腺癌2種，近年雖然EC治療取得了一定進展，但EC患者生存率并未顯著提高［10］。EC細胞侵襲和遷移是其轉移的關鍵，也是影響其療效和預后的主要原因［11］。因此，深入研究EC侵襲遷移的機制，有望為EC治療提供新靶點，對其治療具有重要意義。腫瘤轉移是復雜的生物學過程，涉及黏附分子、蛋白溶酶、細胞因子和生長因子及相關信號通路等，機制復雜［12-13］。目前對腫瘤轉移的認識有限，現已發現的轉移相關分子不足以解釋轉移的各層面，分子機制尚未明確。表觀遺傳學為人EC轉移研究提供了新的思路，也為阻止和治療EC轉移提供了新方案。

SMC4作為染色體腺苷三磷酸酶中SMC家族重要成員，是維持細胞周期中S期正常進展的關鍵蛋白。近期研究發現，SMC4在肝癌組織中異常高表達，且與血管侵犯密切相關［14］。上調SMC4表達可通過轉化生長因子β（TGF-β）∕Smad信號通路促進膠質瘤增殖侵襲，因此SMC4在腫瘤發生發展過程中起重要作用［15］。本研究采用IFA法檢測SMC4在EC組織和癌旁正常組織中的表達，結果顯示SMC4在EC組織中的陽性表達率為83.33%，在癌旁組織中的陽性表達率為10.53%，SMC4在EC組織中的陽性表達率高于癌旁組織（P＜0.001）。進一步分析SMC4表達與EC臨床病理學參數的關系，結果顯示SMC4蛋白表達與EC患者年齡、性別無關，而與腫瘤直徑、TNM臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移及組織分化程度密切相關（P＜0.05）。為進一步探討SMC4對EC侵襲、遷移的影響，本研究采用細胞轉染技術構建了SMC4下調細胞株，MTT結果顯示，與Control組 和KYSE170-siNC組 相 比，KYSE170-siSMC4組細胞在第4、5、6天增殖能力明顯下降（P＜0.05），Eca-109-siSMC4組第4、5、6天增殖能力明顯低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05）。提示下調SMC4表達可明顯抑制KYSE170和Eca-109細胞增殖。采用Transwell和劃線法檢測細胞侵襲遷移能力，結果顯示，KYSE170-siSMC4組細胞侵襲和遷移能力顯著低于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05），Eca-109-siSMC4組細胞侵襲和遷移能力顯著低于Control組和Eca-109-siNC組（P＜0.05），提示下調SMC4表達可抑制EC細胞KYSE170和Eca-109增殖、侵襲和轉移。

EMT是具有上皮形態和功能的細胞表現出間質細胞樣特征的生理和病理學過程，常因極性和細胞間連接消失、細胞骨架重排而形成［16］。EMT是胃癌、結直腸癌、肺癌及乳腺癌等多種實體腫瘤侵襲及轉移的重要進程，其原因為EMT是腫瘤細胞從腫瘤母體脫離并向周圍組織侵襲及遠處轉移的起點，可減弱腫瘤細胞間黏附力，增強其生存及侵入間質的能力［17］。細胞黏附分子鈣黏蛋白家族成員中的神經性鈣黏蛋白（N-cadherin）常被作為間質樣細胞的標志物，且被證實在多種腫瘤EMT進程中表達升高［18］。本研究經IFA及共聚焦顯微鏡觀察發現，下調SMC4表 達 的EC細胞KYSE170中N-cadherin表達顯著下降，說明SMC4可促進N-cadherin表達，即可促進EC細胞EMT進程。

PI3K∕AKT在腫瘤增殖、侵襲和遷移過程中起重要作用，激活的PI3K可使質膜產生3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP3可與Akt結合促使其從細胞質轉至細胞膜從而獲得催化活性，激活（磷酸化）的Akt從細胞膜脫落進入細胞質或細胞核，從而調控細胞運動和凋亡［19］。研究顯示，乳腺癌中SMC4可促進PI3K∕AKT信號通路表達［20］。本研究顯示，KYSE170-siSMC4組p-PI3K和p-Akt表達水平明顯低于Control組和KYSE170-siNC組（P＜0.05），提示下調SMC4表達可抑制PI3K∕AKT信號通路活性。

綜上所述，下調SMC4表達可抑制人EC細胞增殖、侵襲和轉移，并通過降低EMT相關分子N-cadherin表達抑制EMT進程，其作用機制可能與PI3K∕AKT信號通路有關。