PD-1阻斷增強體外擴增的NK細胞對人非小細胞肺癌殺傷作用的研究①

王賀雙 紀 軍 吳園園 潘艷艷 高雁艷 楊 晉 孫曉彤 張 利

（大連市中心醫院中心實驗室，大連116033）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是臨床上常見的呼吸道腫瘤疾病之一［1］。有研究報道顯示，NSCLC的發病率約占肺癌的85%以上［2］。流行病學發現，NSCLC的發病率呈現逐年上升趨勢，臨床中主要表現為胸部脹痛、咳血、低熱、疲乏、體重減輕等［3］。NK細胞屬于大顆粒T淋巴細胞，同時也是人體免疫系統重要的效應細胞，在患者的腫瘤的入侵過程中，具有預先致敏效果［4］。在對患者的治療中，用于免疫治療的NK細胞主要來自患者的外周血。臨床研究發現，異體NK細胞的輸注治療效果優于自體輸注。抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）治療已經在血液腫瘤系統的治療中得到確認［5］。PD-1主要表達于患者抗原呈遞細胞，對于患者的免疫系統的調控具有負性作用。在對NK細胞的擴增過程中，PD-1阻斷增強作用，對于患者的治療具有積極的意義［6］。本研究通過對PD-1阻斷增強體外擴增的NK細胞對NSCLC殺傷作用的研究，為臨床診斷提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究所采用的外周血單個核細胞主要來自健康人群的外周靜脈血；NSCLC主要來自中國科學院的HCC827細胞。所有健康人群均簽署知情同意書。將以上兩種細胞接種于含有10%的胎牛血清的RPMI1640的培養基中，37℃，CO2培養箱孵育過夜，間隔1 d進行營養液更換。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞的體外擴增90% NK培養液采用10%FBS、2 mmol∕L GlutaMAX、10 μg∕ml的青霉素進行混勻。將外周血單個核細胞置于離心管中，放入等量的Ficoll液體，形成明顯的分離液體層。1 800 r∕min離心20 min，使用移液槍將分離層中間的白膜層取出，將白膜層放于其體積為3倍的PBS液體中，混勻，再次1 800 r∕min離心20 min，棄去上清液，使用PBS液體清洗，再次1 800 r∕min，離心20 min，取出對實驗有影響的混雜血小板成分。將以上得到的細胞分別接種于6孔板中，分別在6孔板中加入PBS液體稀釋的CD16抗體（5 μg∕ml）以及重組IL-2（500 U∕ml），溫箱培育5 d，孵育溫度設定為37℃，孵育第5天，采用臺盼藍進行染色，顯微鏡下進行計數，隨后添加重組IL-2。從第6天開始，隔天進行計數，繼續對其進行培養，第9天，根據細胞的數量，及時將以上培養細胞轉移到T25培養瓶中繼續培養，培養過程中添加重組IL-2，分別在培養過程中的0 d、14 d、21 d以及25 d采用流式細胞儀進行NK細胞純度檢測［7］。

1.2.2 NK細胞的PD-1阻斷增強 分別將細胞加入離心管1、2、3中，向離心管2中加入5 μl PD-L1抗體，向離心管3中加入5 μl PD-L2抗體，混合均勻后，在4℃下靜置30 min后，分別向離心管1～3中加入1%的PBS液體再次1 800 r∕min離心20 min。棄去上清液，分別向離心管2～3中加入5 μl抗鼠IgGPE抗體，混合均勻后，室溫下靜置30 min。再次向離心管1～3中加入PBS液體再次1 800 r∕min離心20 min。棄去上清液，加入1%的PBS液體500 μl，重懸細胞，采用流式細胞儀進行NK細胞純度檢測。

1.2.3 PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的殺傷作用 取HCC827細胞置于96孔板中，貼壁后，使用1.2.1培養10 d的PD-1阻斷增強NK細胞以及未進行PD-1阻斷增強NK細胞，濃度分別為0.25、0.5、1 μmol∕L（HCC821細胞與NK細胞的比例設定為1：5），分別培養24 h、48 h、96 h，培養結束后，去掉培養基后，使用酶標儀對HCC827細胞的抑制率進行分析。本研究中以PD-1阻斷增強NK細胞培養的HCC827細胞作為觀察組，以未進行PD-1阻斷增強NK細胞培養的HCC827細胞作為對照組，以培養24 h、48 h、96 h的細胞分別作為觀察組和對照組的凋亡組。（HCC827細胞與NK細胞的比例設定為1：5）HCC827細胞的生長抑制率=［1-（觀察組吸光度值-觀察組凋亡吸光度值）∕（對照組吸光度值-對照組凋亡吸光度值）］×100%［8］。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 PD-1阻斷增強NK細胞毒性分析 分別對離心管1、2、3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較。PD-L1以及PD-L2表達水平采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4.2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較 分別對0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平使用流式細胞儀進行檢測。在實驗過程中，NK細胞的純度在80%以上，數量為1×106個。

1.2.4.3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較 分別對0.25、0.5、1 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率進行比較。

1.3 統計學方法 數據均采用SPSS20.0軟件進行分析。其中計量資料以±s表示，計數資料以［n（%）］表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析 本研究中，通過對NK細胞的純度進行分析，0、14、21及25 d NK細胞的 純 度分別為（0.12±0.03）%、（25.33±4.11）%、（39.94±4.58）%、（79.85±6.97）%。通過對離心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較，以及對NK細胞的PD-1阻斷增強作用，其PD-L1以及PD-L2表達水平顯著下降，差異存在統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

表1 PD-1阻斷增強NK細胞的細胞毒性分析（±s，μg/ml）Tab.1 PD-1 blockade enhances cytotoxicity of NK cells（±s，μg/ml）

Groups TUBE1 TUBE2 TUBE3 F P PD-L1 2.55±0.23 0.15±0.16 1.26±0.29 12.632 0.000 PD-L2 2.69±0.52 1.51±0.51 0.26±0.29 13.069 0.000

2.2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較 通過對不同濃度的PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較，不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平之間的差異存在統計學意義（P＜0.05，表2）。通過分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平達到高峰。

表2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

表2 PD-1阻斷增強NK細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平比較（±s，%）Tab.2 PD-1 blockade enhances expression of granzyme B，perforin and CD107a in NK cells（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Granzyme B 80.88±2.33 90.03±2.02 86.23±2.11 9.887 0.000 Perforin 86.27±2.72 94.22±1.84 89.32±2.12 5.998 0.000 CD107a 68.17±2.34 71.20±2.92 69.83±1.39 6.791 0.000

2.3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較 如表3所示，通過不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較，三組PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率之間的差異存在統計學意義，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率顯著高于其他兩組。

表3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con?centrations（±s，%）

表3 不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of inhibition rate of NK cells on HCC827 cells by PD-1 blockade at different con?centrations（±s，%）

Groups 0.25 μmol∕L 0.5 μmol∕L 1 μmol∕L F P Inhibition rate 40.20±2.91 80.91±3.23 60.77±1.13 11.033 0.000

3 討論

NSCLC是臨床較為常見的肺癌類型之一，在對腫瘤細胞的抑制性治療中，NK細胞的含量在一定程度上反應機體的免疫功能以及對腫瘤細胞的殺傷作用。NK細胞的活性最早發現于19世紀70年代，隨著醫學的不斷發展，人們對于NK細胞的生物學功能以及抗腫瘤作用的研究有了飛躍的發展，有研究報道顯示NK細胞在免疫系統以及對抗惡性腫瘤中發揮重大作用［8］。NK細胞主要分布在外周血以及脾臟中，在患者遭遇病毒、細菌以及腫瘤侵入過程中，起到預先致敏作用［9-10］。近年來的研究顯示，NK細胞的免疫記憶功能，也進一步增強機體的適用性免疫功能［11］。在以往的研究中，通過對抗PD-1的NK細胞治療，已經在血液腫瘤細胞的治療中得到證實。

通過對離心管1～3中的PD-L1以及PD-L2表達水平進行比較，PD-L1以及PD-L2表達水平顯著下降，分析認為，PD-L1以及PD-L2作為PD-1的配體，其含量顯著降低，提示，本研究采用的NK細胞的PD-1阻斷增強作用顯著成功。通過不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率比較，不同濃度PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率之間的差異存在統計學意義，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對HCC827細胞的抑制率顯著高于其他兩組，提示，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞與HCC827細胞充分接觸后，降低PD-1、PD-L1以及PD-L2的連接性，T細胞的PD-L1以及PD-L2的活性顯著性抑制，對于非小細胞肺癌腫瘤細胞的增殖具有顯著的抑制性作用。生理學研究發現，PD-1陽性的T細胞通常被認為是較為疲憊的效應細胞，在腫瘤患者中，通過與T細胞PD-L1連接［12-14］。通過對功能效應以及擴增指數的降低，進而在一定程度上增強患者腫瘤細胞的擴增。同時在對患者的治療過程中，最為合適的NK細胞的治療劑量尚未明確，之前的動物實驗中，通過對動物的NK細胞的輸注，尚未發現劑量依賴性的不良反應，而在治療中，目前治療劑量為108～109個∕kg，在正常情況下，PD-1、PD-L1以及PD-L2的相互作用可導致磷酸酶的活化從而抑制T細胞的受體信號的傳導，以及對免疫應答的負性調節［15］。同時，PD-1、PD-L1以及PD-L2的連接性作用，還可以通過對亮氨酸的AFP的轉錄因子的上調作用，進而對T細胞的增殖以及細胞因子的分泌進行抑制。而通過對NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平的分析，在0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞的細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達水平達到高峰。提示在PD-1阻斷作用能顯著提升對腫瘤細胞的脫顆粒以及溶細胞功能。范曉杰等［16］通過對三陰性乳腺癌患者的分析認為，對患者的PD-1阻斷有望成為日后治療的方向，與本研究相互印證。

但是本研究還存在一定的局限性，由于倫理學的限制，尚未進行人體試驗，有望在日后的研究中進行。

綜上所述，0.5 μmol∕L PD-1阻斷增強NK細胞對小細胞肺癌的細胞阻斷作用顯著，其對腫瘤細胞的殺滅作用的機制主要與活化型受體的升高有關。