SPACE肽修飾成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21的制備及對(duì)小鼠皮膚瘢痕形成的抑制作用

曾 靜 熊 慶 張麗麗 袁 娟 何 瑩 邱黎菲（都江堰市人民醫(yī)院醫(yī)療美容科，都江堰611830）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）屬于FGF基因家族，主要分布于肝臟、胰腺、脂肪等組織，在糖脂代謝、胰島素抵抗、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用［1-3］。近年來，F(xiàn)GF21的抗纖維化作用在腎臟、胰腺、心臟等器官中得到證實(shí)，但是其是否能夠緩解皮膚瘢痕的纖維增生尚未見報(bào)道［4-7］。

皮膚角質(zhì)層是大分子蛋白的天然屏障，而且皮膚瘢痕中高度增厚的真皮也是FGF21難以有效發(fā)揮作用的障礙［8］。SPACE（skin penetrating and cell entering）肽作為一種皮膚穿透肽，已成功用于小干擾RNA、鏈霉親和素、透明質(zhì)酸等物質(zhì)的皮膚遞送，在載藥透皮中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)在FGF21的下游引入SPACE編碼序列，構(gòu)建pET-28a-FGF21-SPACE質(zhì)粒，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得FGF21-SPACE重組蛋白，并制備相應(yīng)的卡波姆凝膠制劑。隨后建立博來霉素誘導(dǎo)小鼠皮膚瘢痕模型，考察該模型下FGF21-SPACE的透皮能力及對(duì)皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)、血管生成、纖維化因子表達(dá)的影響，從動(dòng)物模型的角度初步驗(yàn)證FGF21-SPACE對(duì)皮膚瘢痕形成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性的C57BL∕6小鼠，7～8周齡，體重（23±3）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)溫度：（25±2）℃，相對(duì)濕度：50%～60%，分籠飼養(yǎng)，自然光照射，自由飲食和進(jìn)水，飼養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器IPTG、博來霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Ni-agarose親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；抗FGF21抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；其余一抗抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；卡波姆980購(gòu)自青島天力源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)小鼠FGF21的成熟蛋白質(zhì)序列（NCBI序列號(hào)：NP_064397.1），結(jié)合大腸桿菌密碼子偏好性，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。在FGF21的上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，在FGF21的下游引入SPACE與XhoⅠ酶切位點(diǎn)，該序列即為FGF21-SPACE編碼序列，將其插入至pET-28a質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司合成pET-28a-FGF21-SPACE質(zhì)粒。合成pET-28a-FGF21對(duì)照質(zhì)粒，即無SPACE編碼序列外，其余序列同F(xiàn)GF21-SPACE。

1.2.2 蛋白的表達(dá)與鑒定 將測(cè)序正確的pET-28a-FGF21與pET-28a-FGF21-SPACE質(zhì) 粒 轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)菌中，常規(guī)培養(yǎng)后，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體、超聲破碎等步驟后收集含重組蛋白的上清。使用Ni-agarose親和層析柱純化，冷凍干燥后獲得重組蛋白。使用SDS-PAGE檢測(cè)FGF21與FGF21-SPACE的分子量，并使用Western blot鑒定，抗FGF21抗體的孵育濃度為1：2 000。

1.2.3 凝膠的制備 參照祁萬強(qiáng)等［11］的研究制備凝膠，具體步驟為：將0.6 g卡波姆980加入至30 ml蒸餾水中，靜置12 h。使用500 μl的蒸餾水溶解1 μg重組蛋白質(zhì)，然后加至卡波姆絮狀液中，混合均勻。緩慢滴加三乙醇胺溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.4～7.5，離心去除氣泡，放置4℃冰箱待用。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)透皮能力 根據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道對(duì)C57BL∕6小鼠進(jìn)行皮膚瘢痕造模，具體步驟為：在1 cm×1 cm的區(qū)域皮下注射100 μl的博來霉素（1 mg∕ml），每日1次，連續(xù)注射21 d。博來霉素誘導(dǎo)后次日，在誘導(dǎo)區(qū)域分別涂抹空白凝膠、FGF21凝膠與FGF21-SPACE凝膠，然后用無菌紗布及膠帶固定。48 h后取該處皮膚組織，常規(guī)制備石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)重組蛋白氨基端攜帶的His標(biāo)簽，抗His抗體的孵育濃度為1：100。

1.2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與處理 將40只C57BL∕6小鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、模型組、FGF21組、FGF21-SPACE組，每組10只。除對(duì)照組皮下注射相同體積的生理鹽水，其余3組均進(jìn)行皮膚瘢痕造模。博來霉素誘導(dǎo)后次日，F(xiàn)GF21組在博來霉素誘導(dǎo)區(qū)域涂抹含F(xiàn)GF21重組蛋白質(zhì)的凝膠；FGF21-SPACE組涂抹含F(xiàn)GF21-SPACE重組蛋白質(zhì)的凝膠；對(duì)照組和模型組涂抹空白凝膠作為對(duì)照。凝膠涂抹完用無菌紗布及膠帶固定。每2 d涂抹1次，共30 d。

1.2.6 HE與Masson染色檢測(cè)形態(tài)學(xué)變化 取皮膚樣本，常規(guī)制備石蠟切片，厚度為5 μm，常規(guī)行HE與Masson染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察和拍照。

1.2.7 免疫熒光染色檢測(cè)CD31、TGF-β1表達(dá) 常規(guī)制備皮膚組織冰凍切片，免疫熒光染色檢測(cè)CD31（1：200）、TGF-β1（1：100）表達(dá)，CD31的檢測(cè)使用Cy3標(biāo)記的二抗，TGF-β1的檢測(cè)使用FITC標(biāo)記的二抗。

1.2.8 Western blot檢測(cè)α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)皮膚組織勻漿后，取樣本進(jìn)行SDSPAGE電泳與電轉(zhuǎn)膜，分別使用抗α-SMA抗體（1：1 000）、抗纖連蛋白抗體（1：1 000）、抗膠原蛋白Ⅰ抗體（1：2 000）、抗GAPDH抗體（1：3 000）4℃過夜孵育。次日，二抗孵育后顯色及拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，表示為±s，多組間的比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FGF21-SPACE重組蛋白的表達(dá)與鑒定FGF21與FGF21-SPACE的理論分子量分別為25.54 kD與26.61 kD，與SDS-PAGE電泳圖的條帶相一致，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，兩重組蛋白均可與抗FGF21抗體特異性結(jié)合，見圖1B。

圖1 SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)FGF21-SPACE重組蛋白的表達(dá)Fig.1 SDS-PAGE and Western blot were used to detect expression of recombinant FGF21-SPACE

2.2 FGF21-SPACE重組蛋白透皮能力的檢測(cè) 對(duì)His標(biāo)簽進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示FGF21-SPACE凝膠的His染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于FGF21凝膠，而空白凝膠則為陰性染色，見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮膚組織中His的表達(dá)與分布（×100）Fig.2 Immunohistochemical staining was used to detect ex?pression and distribution of His in skin tissue（×100）

2.3 FGF21-SPACE重組蛋白抑制真皮增厚和纖維化 對(duì)皮膚組織進(jìn)行HE與Masson染色，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組的真皮明顯增厚，纖維化程度升高，而FGF21組與FGF21-SPACE組則抑制該效應(yīng)，且FGF21-SPACE組效果更好，見圖3。

圖3 HE與Masson染色檢測(cè)皮膚組織的形態(tài)學(xué)變化Fig.3 HE and Masson staining was used to detect mor?phological changes of skin tissue

2.4 FGF21-SPACE重組蛋白促進(jìn)血管內(nèi)皮生成 對(duì)CD31的表達(dá)進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示對(duì)照組、FGF21組、FGF21-SPACE組的CD31染色強(qiáng)度均明顯高于模型組，且FGF21-SPACE組的CD31染色強(qiáng)度高于FGF21組，見圖4。

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)皮膚組織中CD31的表達(dá)Fig.4 Immunofluorescence staining was used to detect ex?pression of CD31 in skin tissue

2.5 FGF21-SPACE重組蛋白下調(diào)TGF-β1表達(dá) 對(duì)TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示對(duì)照組、FGF21組、FGF21-SPACE組的TGF-β1染色強(qiáng)度均明顯低于模型組，且FGF21-SPACE組的TGF-β1染色強(qiáng)度低于FGF21組，見圖5。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)皮膚組織中TGF-β1的表達(dá)Fig.5 Immunofluorescence staining was used to detect ex?pression of TGF-β1 in skin tissue

2.6 FGF21-SPACE重組蛋白下調(diào)α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示對(duì)照組、FGF21組、FGF21-SPACE組的α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ表達(dá)量均明顯低于模型組，且FGF21-SPACE組的α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ表達(dá)量低于FGF21組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6和表1。

表1 皮膚組織中α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of α-SMA，fibronectin and collagenⅠexpression in skin tissue

圖6 Western blot檢測(cè)皮膚組織中α-SMA、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)Fig.6 Western blot was used to detect expression of α-SMA，fibronectin，collagenⅠin skin tissue

3 討論

FGF21最初由NISHIMURA等［13］從小鼠的胚胎組織中分離得到，小鼠成熟的FGF21蛋白由210個(gè)氨基酸組成，人FGF21蛋白含209個(gè)氨基酸，兩者具有約75%的同源性。FGF21因具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗等生理作用，而廣泛應(yīng)用于肥胖、2型糖尿、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病［14-15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21還具有較好的抗纖維化作用，如周淼等人在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可以通過激活Nrf2信號(hào)通路，抑制炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而降低細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，緩解肺纖維化進(jìn)程［16］。但是，F(xiàn)GF21是否能夠緩解以纖維化為主要病理特征的皮膚瘢痕形成尚無相關(guān)報(bào)道。

皮膚角質(zhì)層主要由10～20層扁平的角質(zhì)層細(xì)胞組成，其間由彎曲的細(xì)胞間脂質(zhì)填充，形成一種“磚墻”結(jié)構(gòu)，以保護(hù)皮下組織免受微生物、物理、化學(xué)等刺激的傷害，防止水分丟失，但是該結(jié)構(gòu)也是大分子物質(zhì)的天然屏障，是提高皮膚給藥效率面臨的關(guān)鍵問題。隨著噬菌體展示等技術(shù)的發(fā)展，各種皮膚穿透肽逐漸被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，其透皮能力已在胰島素、小干擾RNA等物質(zhì)的遞送中得到證實(shí)［17-19］。SPACE肽是由HSU等［9］通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的兼具透皮和穿膜的新型透皮多肽，可通過巨細(xì)胞胞飲的方式穿透角阮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等各種細(xì)胞類型，皮膚表面應(yīng)用2 h后即可在真皮深處檢測(cè)到其分布情況。例如，CHEN等［10］使用磷脂制備的醇質(zhì)體包裹大分子物質(zhì)透明質(zhì)酸（分子質(zhì)量為200～325 kD），然后表面與SPACE肽共價(jià)連接，對(duì)于小鼠皮膚，該載藥系統(tǒng)的透皮能力較對(duì)照增強(qiáng)5倍左右。因此，本研究擬采用SPACE肽促進(jìn)FGF21透皮，以增強(qiáng)其抗纖維化作用。

為了最大限度減少重組蛋白溶液的蒸發(fā)，保證其持續(xù)透皮，本研究以對(duì)組織及細(xì)胞無損害作用的卡波姆凝膠作為賦形劑，制備了相應(yīng)的卡波姆凝膠制劑。此外，凝膠可提供濕潤(rùn)、穩(wěn)定的微環(huán)境，有利于維持蛋白的生物活性。卡波姆溶液呈酸性，而人體血液及組織液的正常pH值為7.35～7.45，為了使凝膠制劑更適合機(jī)體微環(huán)境，使用三乙醇胺溶液將其調(diào)節(jié)至微堿性［11］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其透皮能力，對(duì)重組蛋白攜帶的His標(biāo)簽進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果表明SPACE肽能夠有效促進(jìn)FGF21穿透表皮，進(jìn)入真皮深層。

博來霉素是一種致纖維化藥物，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的纖維化造模，本研究則通過皮下注射博來霉素誘導(dǎo)小鼠皮膚瘢痕模型。HE與Masson染色結(jié)果提示FGF21具有抗纖維化效應(yīng)，而且SPACE肽可以增強(qiáng)該效應(yīng)。在缺氧環(huán)境下，受損的內(nèi)皮細(xì)胞通常會(huì)代償性增生以促進(jìn)血管恢復(fù)，但是該過程在嚴(yán)重的瘢痕形成中受到抑制，并表現(xiàn)為血管缺乏［20］。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，本研究對(duì)CD31表達(dá)進(jìn)行了免疫熒光染色，結(jié)果提示FGF21-SPACE可以促進(jìn)血管生成，恢復(fù)氧供。在本研究中，我們觀察到博來霉素可以誘導(dǎo)TGF-β1水平明顯升高，這與其他報(bào)道一致，認(rèn)為TGF-β1可通過減少抗氧化劑的合成并促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，從而增加氧化應(yīng)激，是纖維化形成的關(guān)鍵因子［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，F(xiàn)GF21可以抑制TGF-β1表達(dá)，與本研究結(jié)果相一致，而且FGF21-SPACE對(duì)TGF-β1表達(dá)的抑制效應(yīng)優(yōu)于FGF21［22］。在纖維化過程中，成纖維細(xì)胞可向成肌纖維細(xì)胞分化，α-SMA則是其表達(dá)的一種特征性收縮性蛋白，并且向細(xì)胞外分泌纖連蛋白與膠原蛋白。Western blot結(jié)果表明FGF21-SPACE重組蛋白可以降低纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，與上述抗纖維化效應(yīng)相印證。

綜上所述，F(xiàn)GF21-SPACE重組蛋白具備較好的透皮能力，可以抑制皮膚瘢痕形成，促進(jìn)血管生成，降低纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，具有較好的應(yīng)用前景。