miR-377調控THEM4對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞EMT的作用

譚德敏 曾雨如 向海燕 張明霞 劉 珊 張 瑤（湖北民族大學附屬民大醫院腎內科，恩施445000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）被定義為腎臟受累的糖尿病，表現為蛋白尿和∕或腎小球濾過率受損［1］。DN是一種微血管并發癥，可引起腎纖維化進展，最終導致不可逆的腎損害［2］。目前，DN的發病機制尚不完全明確，普遍接受的假說包括基底膜增厚、腎小管上皮間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）積累、腎小球硬化、腎小管間質纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）等［3-4］。上皮細胞向運動性間充質細胞的轉分化過程稱為EMT，EMT在發育、傷口愈合和干細胞行為中是不可或缺的，并在病理學上有助于纖維化和癌癥的進展［5］。既往研究表明，EMT與DN的加速纖維化有關，腎小管細胞在受到損傷或局部激活后會失去上皮表型并獲得間質細胞特有的纖維化特征［6］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長約22個核苷酸的RNA，主要通過與mRNA的3′非編碼區（3′untranslated region，3′UTR）的不完全互補結合，作為轉錄后基因表達的生理和病理調節因子。miRNA在包括糖尿病性腎病在內的多種腎臟疾病中異常表達，成為DN重要的治療干預靶點［7-8］。有研究發現微小RNA-377（microRNA-377，miR-377）與DN的發生發展密切相關，且發現在DN患者中miR-377異常高表達，可能與腎臟病變程度有關，但miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞EMT的影響及其機制目前還未有研究［9-10］。硫酯酶超家族成員4（thioesterase superfamily member 4，THEM4）在DN中發揮重要作用，THEM4低表達可能引起糖尿病小鼠腎小管間質ECM沉積［11］。基于此，本研究構建高糖損傷近端腎小管上皮細胞HK-2模型，觀察miR-377在其中的表達及其對細胞EMT的影響，并結合THEM4探索其可能的作用機制，為DN腎小管EMT提供潛在的干預靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人近端腎小管上皮細胞HK-2購自中國典型培養物保藏中心細胞庫；DMEM培養基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-377、anti-miR-377、pcDNA3.1-THEM4、si-THEM4及各自的陰性對照購自廣州銳博生物有限公司；實時熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）相關試劑盒購自日本TaKaRa公司；THEM4蛋白一抗購自美國Protein Tech公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養HK-2細胞加入DMEM培養基（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2的培養箱中常規培養。2～3 d換液1次，按照1：3的比例接種傳代。

1.2.2 細胞轉染與處理 收集對數生長期的HK-2細胞，以適當密度接種于6孔板，當細胞融合至70%，嚴格按照Lipofectamine 2000試劑說明書指示，將miR-377、anti-miR-377、pcDNA3.1-THEM4、si-THEM4及各自的陰性對照轉染至HK-2細胞，并使用30 mmol∕L葡萄糖處理。將細胞分為正常葡萄糖組（NG組：5 mmol∕L葡萄糖）、高糖組（HG組：30 mmol∕L葡萄糖）、HG+miR-NC組（HG+轉染miR-NC）、HG+miR-377組（HG+轉染miR-377）、HG+anti-miR-NC組（HG+轉染anti-miR-NC）、HG+anti-miR-377組（HG+轉染anti-miR-377）、HG+miR-377+pcDNA3.1組（HG+共 轉 染miR-377+pcDNA3.1）、HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4組（HG+共轉染miR-377+pcDNA3.1-THEM4）、HG+miR-377+si-NC組（HG+共轉染miR-377+si-NC）和HG+miR-377+si-THEM4組（HG+共轉染miR-377+si-THEM4）組。48 h后收集細胞備用。

1.2.3 qPCR檢測miR-377表達 使用Trizol試劑提取HK-2細胞中的RNA，經逆轉錄試劑盒制成cDNA，根據qPCR試劑盒說明書，進行miR-377表達的測定。miR-377正向引物序列為5′-GAGCAGAGGTTGCCCTTG-3′，反向引物序列為5′-ACAAAAGTTGCCTTTGTGTGTGA-3′（擴增片段長度為53 bp）。內參GAPDH正向引物序列為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物序列為5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。miR-377的表達量通過2-ΔΔCt法計算得出。

1.2.4 Western blot檢 測Vimentin、E-cadherin、THEM4蛋白表達HK-2細胞加入裂解液以提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，吸取30 μg蛋白樣品進行10% SDSPAGE電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃條件下加入Vimentin、E-cadherin、THEM4一抗（稀釋度為1：1 000）孵育過夜，之后加入二抗（稀釋度為1：5 000）室溫孵育2 h，置增強化學發光液顯影，以GAPDH為內參，分析Vimentin、E-cadherin、THEM4蛋白條帶灰度值。

1.2.5 生物信息學預測與雙熒光素酶實驗Starbase網站（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預測發現miR-377與THEM4的3′UTR部分堿基 可形成互補配對。分別構建包含miR-377結合位點的野生型THEM4（WT-THEM4）或 突 變 型THEM4（MUTTHEM4）3′UTR報告基因載體，利用Lipofectamine 2000試劑將miR-NC、miR-377分別與WT-THEM4、MUT-THEM4共轉染，培養48 h后檢測雙熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行數據的統計分析。所有計量數據結果以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響qPCR檢測結果表明，與NG組相比，HG誘導的HK-2細胞中miR-377表達量明顯升高；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-377組miR-377表 達 量 明 顯 升 高（P＜0.05，圖1A）。Western blot檢 測發現，與NG組相比，HG誘 導的HK-2細胞內Vimentin蛋白表達量明顯升高，E-cadherin蛋白水平明顯降低；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-377組HK-2細胞的Vimentin蛋白表達量明顯升高，E-cadherin蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖1B、C）。

圖1 過表達miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響Fig.1 Effect of overexpression of miR-377 on EMT of high glucose-induced human proximal renal tubu?lar epithelial cells HK-2

2.2 抑制miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響qPCR檢測數據顯示，與NG組相比，HG誘導的HK-2細胞中miR-377表達量明顯升高；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+antimiR-377組miR-377表達量明顯降低（P＜0.05，圖2A）。Western blot檢測結果表明，與NG組相比，HG誘導的HK-2細胞內Vimentin蛋白水平明顯升高，Ecadherin蛋白表達量明顯降低；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-377組Vimentin蛋白水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達量明顯升高（P＜0.05，圖2B、C）。

圖2 抑制miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響Fig.2 Effect of inhibition of miR-377 on EMT of high glu?cose-induced human proximal renal tubular epithe?lial cells HK-2

2.3 miR-377靶向調控THEM4 Starbase網站預測發現，THEM4的3′UTR含有與miR-377互補的核苷酸序列（圖3A）。雙熒光素酶實驗結果顯示，與miR-NC組 相比，miR-377明 顯抑 制WT-THEM4的熒光素酶活性（P＜0.05），對MUT-THEM4熒光素酶活性無明顯影響（圖3B）。Western blot檢測結果表明，與miR-NC組相比，轉染miR-377明顯降低THEM4蛋白的表達；與anti-miR-NC組相比，轉染anti-miR-377明顯提高THEM4蛋白水平（P＜0.05，圖3C、D）。

圖3 miR-377靶向調控THEM4Fig.3 miR-377 targets regulates THEM4

2.4 過表達THEM4能逆轉過表達miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響 與HG+miR-377+pcDNA3.1組相比，HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4組HK-2細胞中THEM4、E-cadherin蛋白水平明顯升高，Vimentin蛋白表達量明顯降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 過表達THEM4能逆轉過表達miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響Fig.4 Overexpression of THEM4 reversed effect of over?expression of miR-377 on EMT of high glucose-in?duced human proximal renal tubular epithelial cells HK-2

2.5 抑制THEM4能逆轉抑制miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響 與HG+miR-377+si-NC組相比，HG+miR-377+si-THEM4組HK-2細胞的THEM4、E-cadherin蛋白表達明顯降低，Vimentin蛋白水平明顯升高（P＜0.05，圖5）。

圖5 抑制THEM4能逆轉抑制miR-377對高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的影響Fig.5 Inhibition of THEM4 reversed effect of miR-377 on EMT of high glucose-induced human proximal re?nal tubular epithelial cells HK-2

3 討論

DN是腎衰竭的主要原因，也是糖尿病的主要致死并發癥。DN的自然病史包括腎小球超濾，進行性尿蛋白，腎小球濾過率下降，最后是終末期腎病［12］。作為糖尿病的主要并發癥之一，約20%～40%的1型和2型糖尿病患者受DN的影響，最終發展為終末期腎病［13］。盡管目前有大量治療方法側重于處理DN的主要指標，包括高血糖和高血壓，但仍有大量患者遭受持續進展性和嚴重的腎損傷［14］。因此，表征DN的早期生物標志物，制定減輕DN嚴重程度的治療策略，可阻止DN向終末期腎病進展，改善患者的健康結果。

研究表明，高血糖刺激的EMT在啟動和進展DN的腎纖維化中起關鍵作用［15］。腎小管EMT包括4個步驟：喪失上皮細胞的黏附特性、獲得間充質細胞表型、破壞腎小管基底膜以及遷移至腎間質［16］。其特點是上皮表面標志物E-cadherin表達減少，間質標志物Vimentin表達增加［5］。本研究中，與NG組相比，HG誘導的HK-2細胞中Vimentin蛋白表達明顯增加，E-cadherin蛋白水平明顯降低，與既往研究一致［17］。

miRNA在眾多疾病中扮演至關重要的角色，包括糖尿病、心血管疾病、腎臟疾病和癌癥［18］。大量資料顯示，腎臟中miRNA的異常表達可能導致DN的發生和發展［19］。此外，幾種miRNA被認為是腎EMT的重要介質，如miR-188-5p、miR-145等［20-21］。miR-377已被證明參與糖尿病常見的并發癥，被視為糖尿病并發癥預防策略的潛在新靶點。高糖誘導miR-377水平增加，而miR-377的下調通過直接上調靶基因SIRT1來抑制高糖、缺氧誘導的視網膜內皮細胞血管生成和炎癥，影響糖尿病視網膜病變進展［22］。miR-377在DN小鼠腎臟組織中表達上調，長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1（long non-coding RNA taurine-upregulated gene 1，lncRNA TUG1）通過下調miR-377表達水平減輕高葡萄糖引起的腎小球細胞ECM積累［23］。然而miR-377對在DN細胞EMT中的功能尚未可知。本研究中，qPCR檢測數據顯示，與NG組相比，HG誘導的HK-2細胞中miR-377表達量明顯增加，與前述研究相同。過表達miR-377顯著增加高糖誘導的HK-2細胞中Vimentin蛋白表達量，明顯降低E-cadherin蛋白水平，抑制miR-377則反之，可以降低Vimentin蛋白水平而顯著增加E-cadherin蛋白表達量。表明miR-377在高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞EMT過程中可能具有促進作用。

據報道，過表達THEM4可抑制高糖誘導的人腎小管上皮細胞膠原分泌［24］。在糖尿病小鼠腎組織中，THEM4 mRNA和蛋白表達明顯下調，過表達THEM4可明顯減輕糖尿病小鼠ECM積聚［25］。以上研究表明，THEM4能夠減輕DNECM沉積，從而發揮一定的保護作用。本項研究中，生物信息學預測和雙熒光素酶實驗結果顯示，THEM4是miR-377的功能性靶基因。并且，上調或下調miR-377明顯抑制或促進THEM4的蛋白表達。過表達THEM4能逆轉過表達miR-377促進高糖誘導的HK-2細胞Vimentin蛋白表達的作用，并逆轉其抑制E-cadherin蛋白表達的作用。同時，抑制THEM4能逆轉抑制miR-377對高糖誘導的HK-2細胞內Vimentin蛋白表達的抑制作用，以及對E-cadherin蛋白表達的促進作用。這些結果證實，靶向調控THEM4的表達可能是miR-377誘導高糖損傷的近端腎小管上皮細胞HK-2 EMT的重要途徑之一。

綜上所述，miR-377在高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞明顯上調，過表達miR-377可誘導EMT過程，抑制其表達時作用相反，其作用機制與靶向調控THEM4表達有關，為DN的發病機制提供了新的見解。