PRDM1調(diào)控NF-κB信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化和功能的影響①

張夢(mèng)瑩 李 志 李雪琴 鐘 民 呂 坤

（皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，蕪湖241001）

巨噬細(xì)胞作為一種極具可塑性和多能性的細(xì)胞群體，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著不可替代的作用［1-3］。在機(jī)體微環(huán)境不同刺激物的影響下，可向不同類型分化且功能各異（主要分為M1型和M2型）［4-5］。B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1（B-lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1），又稱為PR結(jié)構(gòu)域蛋白1，已知它在B淋巴細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞并分泌大量免疫因子的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而調(diào)控機(jī)體的免疫狀態(tài)［6-7］。并且正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白1（positive regulatory domain zinc finger protein 1，PRDM1）在人和小鼠的T細(xì)胞中均有表達(dá)，且高表達(dá)于CD4+和CD8+細(xì)胞系的效應(yīng)及記憶細(xì)胞中［8-9］。同時(shí)PRDM1在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)上也發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-11］。由此提示PRDM1可能與T細(xì)胞的分化和功能密切相關(guān)。因此本課題組前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)芯片微陣列分析數(shù)據(jù)（國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)：GSE81922）篩查發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）體外極化過(guò)程中，PRDM1表達(dá)存在差異，與M1相比，M2中PRDM1下調(diào)表達(dá)最為明顯，提示其與巨噬細(xì)胞體外極化密切相關(guān)［12］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription faetor，NF-κB）是一種可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核因子，被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞極化的重要調(diào)控因子，參與了TLR誘導(dǎo)的M1極化［13-14］。因此，本研究以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建過(guò)表達(dá)腺病毒PRDM1，探索PRDM1是否通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響B(tài)MDMs的極化，為其在巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、2.5 g∕L胰蛋白酶（Gibco公司），高糖DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），F(xiàn)irst-Strand cDNA Synthesis試劑盒、核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒（美國(guó)Thermo公司），PCR試劑盒（廣州銳博公司），過(guò)表達(dá)PRDM1腺病毒載體（上海漢恒生物科技有限公司），F(xiàn)4∕80、CD11b單克隆抗體（BD公司），PRDM1、p-IKK、IKK、p65、p-p65、β-actin、Histone單克隆抗體（Abcam公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（Biosharp公司），蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物科技公司），ECL發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMDMs培養(yǎng)、體外誘導(dǎo)及鑒定 將小鼠頸椎脫位法處死，75%酒精消毒5～10 min，無(wú)菌獲取雙側(cè)股骨和脛骨，用5 ml注射器吸取L929條件培養(yǎng)液（含有20%胎牛血清、20% L929小鼠成纖維細(xì)胞株培養(yǎng)3 d的上清、100 U∕ml鏈霉素、100 U∕ml青霉素），從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并將細(xì)胞充分混勻，分至6孔培養(yǎng)板中。在L929條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后去除懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞。再加入新鮮的完全培養(yǎng)液RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)1 d后即為BMDMs，同時(shí)消化收集一部分細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。第8 d后吸去上清以PBS緩沖液洗滌2遍，加入新的DMEM完全培養(yǎng) 液，IFN-γ（100 U∕ml）∕LPS（100 ng∕ml）或IL-4（20 ng∕ml）共同刺激培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)出M1∕M2型巨噬細(xì)胞。然后用Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)M1∕M2型特異性表面分子。

1.2.2 腺病毒感染巨噬細(xì)胞 將原代BMDMs在6孔板中培養(yǎng)1周后隨機(jī) 分 成2組：PRDM1 AdV組和陰性對(duì)照（NC）組，感染前吸出完全培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，每孔加入1 ml新鮮培養(yǎng)基，將10 μl PRDM1過(guò)表達(dá)腺病毒載體（1.26×1010PFU∕ml）和對(duì)照病毒載體分別滴入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，感染6～8 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。

1.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子的分泌 收集各組培養(yǎng)的細(xì)胞上清液，以1 500 r∕min離心10 min，保留細(xì)胞上清液。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 巨噬細(xì)胞殺傷功能的檢測(cè) 將腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，加入0.1×106cfu∕ml大腸桿菌（BL21DE3pLysS）至96孔板，并在37℃下孵育1 h。收集上清液，置于37℃的羅勒氏肉湯瓊脂平板上培養(yǎng)24 h，并計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。數(shù)據(jù)以cfu∕ml表示細(xì)菌菌落稀釋因子∕平板稀釋的上清液的體積。

1.2.5 巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè) 將腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，用PE標(biāo)記的微粒（MPs）分別添加到細(xì)胞孔中（500 μg∕孔），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。再用冷PBS洗滌2次后，從孔中收獲細(xì)胞，并用PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠F4∕80抗體染色。最后在CytomicsTMFC500流式細(xì)胞儀（Beckman）上采集細(xì)胞。PE陽(yáng)性細(xì)胞的百分比及其熒光強(qiáng)度使用Flow-Jo軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR收集細(xì)胞 采用Trizol提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以BIO-RAD CFX Manager分析軟件進(jìn)行自動(dòng)分析。使用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因的表達(dá)水平情況。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.7 Western blot用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入適量的含蛋白酶抑制劑復(fù)合物的RIPA裂解液于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r∕min離心20 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白定量后經(jīng)SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，分別加一抗，4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min；室溫用二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例為1∶2 000）孵育1～2 h，TBST沖洗，ECL顯影發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件GraphPad Prism 4.0計(jì)算各組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，各組數(shù)據(jù)以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)體外極化的巨噬細(xì)胞的鑒定BMDMs體外誘導(dǎo)8 d后，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定（圖1A）。再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h，提取總RNA對(duì)M1、M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因進(jìn)行RTqPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，刺激之后M1型和M2型所持有的標(biāo)志基因的表達(dá)有明顯升高（圖1B，P＜0.05）。經(jīng)流式細(xì)胞儀及RT-qPCR檢測(cè)，證實(shí)體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化成功。

圖1 體外極化巨噬細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of polarized macrophages in vitro

2.2 PRDM1在M1和M2巨噬細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平 為了證實(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)M1、M2中PRDM1基因和蛋白的表達(dá)情況。以M1巨噬細(xì)胞的表達(dá)為對(duì)照，結(jié)果顯示，PRDM1在M2巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于M1巨噬細(xì)胞（圖2，P＜0.05）。

圖2 PRDM1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.2 Expression level of PRDM1 in macrophages

2.3 過(guò)表達(dá)PRDM1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響B(tài)MDMs感染PRDM1過(guò)表達(dá)腺病毒載體48 h后，鏡下觀察細(xì)胞的腺病毒感染情況（圖3A）；熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PRDM1過(guò)表達(dá)后BMDMs（PRDM1 AdV組）中PRDM1的mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組（NC組）顯著升高（圖3B，P＜0.001）；Western blot結(jié)果顯示，PRDM1 AdV組BMDMs中PRDM1蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯升高（圖3C、D，P＜0.05）。細(xì)胞感染腺病毒48 h后，再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PRDM1后M1型巨噬細(xì)胞表面分子iNOS、IL-12及TNF-α表達(dá)升高（圖3E，P＜0.01），而M2型巨噬細(xì)胞表面分子Arg1、YM-1及FIZZ1表達(dá)降低（圖3F，P＜0.05）。以上結(jié)果提示PRDM1可能參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的過(guò)程。

圖3 過(guò)表達(dá)PRDM1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響Fig.3 Effect of PRDM1 overexpression on polarization of macrophages

2.4 過(guò)表達(dá)PRDM1對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響 將PRDM1過(guò)表達(dá)腺病毒（PRDM1 AdV組）和陰性對(duì)照（NC組）瞬時(shí)感染BMDMs 48 h后，再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，較NC陰性對(duì)照組，PRDM1 AdV組M1細(xì)胞上清中TNF-α、IL-12的表達(dá)水平上調(diào)，而M2細(xì)胞上清中IL-13的表達(dá)水平下調(diào)（圖4A，P＜0.05）；細(xì)菌殺傷試驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)PRDM1顯著增強(qiáng)了BMDMs的殺菌活性（圖4B，P＜0.05）；吞噬試驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)PRDM1可降低BMDMs的吞噬能力（圖4C，P＜0.05）。結(jié)果表明與PRDM1過(guò)表達(dá)對(duì)M1和M2極化表型影響一致。

圖4 過(guò)表達(dá)PRDM1對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響Fig.4 Effect of PRDM1 overexpression on function of macrophages

2.5 過(guò)表達(dá)PRDM1促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路活化Western blot結(jié)果顯示，在M2型巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PRDM1，NF-κB信號(hào)通路中的下游信號(hào)分子p65及IKK的磷酸化水平較NC組顯著升高。再核質(zhì)分離提取細(xì)胞核蛋白，測(cè)定核內(nèi)p65表達(dá)水平，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)PRDM1后核內(nèi)p65含量較NC組顯著升高（圖5，P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)表明，PRDM1可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路的活化參與調(diào)控巨噬細(xì)胞M1極化。

圖5 過(guò)表達(dá)PRDM1促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路活化Fig.5 Overexpression of PRDM1 promotes activation of NF-κB signaling pathway

3 討論

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在慢性和急性炎癥中都能發(fā)揮重要的作用［15-16］。根據(jù)不同的刺激因素作用，可將活化的巨噬細(xì)胞分為M1和M2兩大類型，M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎和抗原提呈能力，參與誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，直接吞噬和殺傷病原微生物，同時(shí)通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子參與炎癥反應(yīng)［17］；而M2型巨噬細(xì)胞具有抑制炎癥的作用，能促進(jìn)組織的修復(fù)和血管再生，并能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，通過(guò)分泌TGF-β和IL-10等抑制性細(xì)胞因子下調(diào)免疫反應(yīng)從而有效控制炎癥［18-19］。識(shí)別這兩種巨噬細(xì)胞的方式主要是通過(guò)對(duì)其特異性高表達(dá)的標(biāo)志分子檢測(cè)來(lái)鑒別，iNOS、IL-12及TNF-α可用于鑒定M1型巨噬細(xì)胞，而Arg1、YM-1及FIZZ1是鑒定M2型巨噬細(xì)胞較為理想的標(biāo)志分子［20］。巨噬細(xì)胞分泌適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子和趨化因子可導(dǎo)致微環(huán)境的改變，以橋接固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的極性達(dá)到免疫平衡將成為治療炎癥相關(guān)疾病的有效手段。

小鼠PRDM1基因全長(zhǎng)5.1 kb，位于10號(hào)染色體，人的PRDM1基因位于6號(hào)染色體q21-q22.1位置上，全長(zhǎng)29 kb，含有相同的結(jié)構(gòu)區(qū)域。在中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及肌細(xì)胞等都能檢測(cè)到PRDM1的表達(dá)［21］。KALLIES等［22］和MARTINS等［23］發(fā)現(xiàn)PRDM1對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能具有重要作用。另外，PRDM1蛋白在CD4+和CD8+的T細(xì)胞中表達(dá)增加［24-25］。提示PRDM1對(duì)T細(xì)胞的分化有一定影響。為探究PRDM1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用，本文通過(guò)過(guò)表達(dá)巨噬細(xì)胞中PRDM1發(fā)現(xiàn)，PRDM1不僅調(diào)節(jié)M1和M2表型標(biāo)記的表達(dá)，而且還可以控制M1∕M2相關(guān)的巨噬細(xì)胞功能。過(guò)表達(dá)PRDM1能夠增加巨噬細(xì)胞中促炎因子TNF-α、IL-12的表達(dá)，并減少巨噬細(xì)胞中抗炎因子IL-13的表達(dá)；同時(shí)增強(qiáng)了BMDMs的殺菌活性，而降低了巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力。這與M1∕M2巨噬細(xì)胞典型特性相關(guān)［26-27］。上述數(shù)據(jù)表明巨噬細(xì)胞中PRDM1的過(guò)表達(dá)可以抑制M2的表型，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化。

已知NF-κB信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)的“明星通路”，與炎癥免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞M1極化和炎癥反應(yīng)需要NF-κB的參與［28-34］。而磷酸化是NF-κB基于激活的關(guān)鍵步驟。在本研究中，通過(guò)初步觀察信號(hào)通路激活情況，發(fā)現(xiàn)在M2中過(guò)表達(dá)PRDM1，與陰性對(duì)照組相比，NF-κB信號(hào)通路中的下游信號(hào)分子p65、IKK的磷酸化水平明顯升高，且核內(nèi)p65含量也明顯升高，提示NF-κB信號(hào)通路可能參與了PRDM1調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和功能的過(guò)程。

綜上所述，PRDM1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路可能在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中扮演重要角色，至于PRDM1在不同巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的原因，還需要進(jìn)一步研究。