金黃色葡萄球菌類腸毒素K對T淋巴細胞活化特點及抗腫瘤活性研究①

何亞南 孫鈺椋 任雅坤 張勝輝 陳童彤 路依林 郭 睿 劉彥禮 李永海 林俊堂

（新鄉醫學院生命科學技術學院，新鄉453003）

金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是由金黃色葡萄球菌分泌的一類外毒素，由于其超抗原活性成為研究重點［1］。作為典型超抗原，SEs通過直接與主要組織相容性復合物Ⅱ類分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）非限定性結合，無需抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）加工呈遞便可以完整分子形式遞呈給T淋巴細胞，從而活化大量具有特異性TCR Vβ亞群的T淋巴細胞（5%～20%，包括CD4+和CD8+T細胞），隨后釋放大量細胞因子，如IL-2、IFN-γ及TNF-α等，同時產生強烈的細胞介導的細胞毒性作用，尤其對MHCⅡ陽性表達的腫瘤細胞具有較強殺傷作用［2-3］。因此，SEs誘導的免疫激活作用已被廣泛用于抗腫瘤免疫治療研究［4］。但SEs具有誘發機體嘔吐、腹瀉和發熱等毒副作用，一定程度上限制了其臨床應用［5］。

隨著SEs研究深入，2004年國際命名委員會將SEs家族的1個亞組命名為金黃色葡萄球菌類腸毒素（Staphylococcal enterotoxin-like，SEls）［6］，其具有與典型SEs相似的結構及超抗原活性，但無致嘔等副作用，在臨床治療惡性腫瘤中具有潛在應用價值，并已有相關報道［7］。目前已鑒定出一系列SEls成員，包括SElJ、SElK-Q、SElU、SElV和SElX等［8-10］。課題組前期已成功構建并表達高純度SElK［11］。本研究旨在研究SElK對T淋巴細胞的活化作用，并分析其體內外抗腫瘤活性，為進一步闡明SElK超抗原活性提供理論基礎，以期促進SElK在臨床腫瘤治療中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞、外周血6～8周齡SPF級BALB∕c雌性小鼠，體重（24±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001，所有動物實驗均獲得我院動物保護委員會批準，并按照中國動物保護協會要求進行操作；腫瘤細胞株由本實驗室保存；本研究中所用外周血樣本均由本實驗室志愿者知情同意情況下捐贈，相關實驗操作符合我院倫理委員會要求。

1.1.2 主要試劑MTT購自Sigma公司；FBS（胎牛血清）、DMEM高糖培養基和RPMI1640培養基購自Hyclone公司；超純RNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛公司；5×All-In-One RT MasterMix和Prime ScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；CD4-PE和CD8-FITC購自ebioscience公司；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天。

1.1.3 主要儀器HR40-IIA2型超凈工作臺（青島海爾生物醫療股份有限公司）；L3-5K型臺式低速離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；MCO-18AC型CO2培養箱（上海普和希健康醫療器械有限公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司）；5020型PCR儀（Thermo公司）；ABI Prism 7500型qPCR儀（Applied Biosystems公 司）；SpectraMax?i3型酶標儀（Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細胞及人PBMCs分離提取 無菌條件下分離小鼠脾臟，研磨后獲得脾細胞懸液，100 μm不銹鋼篩網過濾，紅細胞裂解液裂解2次，PBS洗2次，含10% FBS的RPMI1640培養基重懸，調整細胞密度至1×107個∕ml備用。抗凝管中新鮮外周血與PBS等體積稀釋，常規密度梯度離心分離獲得人PBMCs，加入紅細胞裂解液裂解殘留紅細胞，洗2次，含10%FBS的RPMI1640培養基重懸PBMCs，調整細胞密度至2×106個∕ml備用。

1.2.2 流式細胞術 小鼠脾淋巴細胞（終密度5×106個∕ml）接種至6孔板，2 ml∕孔，加入SElK（終濃度1 μg∕ml）37℃、5%CO2下刺激小鼠脾淋巴細胞72 h；收集細胞，PBS洗2次，100 μl PBS重懸，分別加入CD4-PE和CD8-FITC單克隆抗體4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，Guava easyCyte流式細胞儀檢測，FlowJo軟件分析。

1.2.3 qPCR將調整后的小鼠脾淋巴細胞（終密度5×106個∕ml）與SElK（終濃度1 μg∕ml）共 培 養48 h，超純RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，5×All-In-One RT Master Mix試劑盒反轉錄1 μg RNA獲得cDNA，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI Prism 7500進行qPCR反應，檢測目的基因表達。小鼠源β-actin、IFN-γ、顆粒酶A（Granzyme A）和顆粒酶B（Granzyme B）特異性引物序列見表1［12-13］，2-ΔΔCt法計算，7500 Software v2.3軟件分析數據。調整后的人PBMCs（終密度1×106個∕ml）與SElK（終濃度1 μg∕ml）共培養48 h，收集細胞cDNA。參考文獻［14］相對定量法及特異性引物進行Vβ譜分析，采用標準曲線計算樣本Vβ和Cβ的絕對拷貝數，計算各Vβ百分比=（Vβn∕Cβ）×100%。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細胞凋亡檢測 將小鼠脾淋巴細胞（終密度5×106個∕ml）接種到至6孔板，3 ml∕孔，加入SElK（終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）與小鼠脾淋巴細胞懸液37℃、5%CO2共培養48 h，收集細胞，按照Annexin V-FITC∕PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞術檢測細胞凋亡，實驗重復3次。

1.2.5 體外抗腫瘤活性檢測 人PBMCs作為效應細胞，BT474和A431細胞作為靶細胞，檢測SElK的體外抗腫瘤活性。靶細胞（BT474：8×103個∕100 μl，A431：3×103個∕100 μl）依次接種于96孔板，37℃、5%CO2培養12 h后移除舊培養基，PBS洗2次，加入人PBMCs懸液（2×105個∕50 μl），加入PBS（50 μl）孔作為對照；分別加入連續稀釋的SE1K（50 μl，終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作為SElK處理組；SElK刺激的人PBMCs（終濃度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作為空白組；僅加入RPMI1640培養基為背景組。37℃、5%CO2培養48 h后加入20 μl MTT繼續培養4 h。2 000 r∕min離心10 min，吸出液體，120 μl∕孔依次加入DMSO。將96孔板置于酶標儀中振蕩20 s，設置測定波長為570 nm，參考波長為630 nm，檢測各孔吸光度（A），計算腫瘤生長抑制率（%）=｛1-［（ASElK處理組-A背景組）-（A空白組-A背景組）］∕（A對照組-A背景組）｝×100%。

1.2.6 體內抗腫瘤活性檢測 小鼠腫瘤模型建立：取8只小鼠，在第0天皮下注射200 μl（2×106個∕只）小鼠乳腺癌細胞（EMT-6）至小鼠右腋下，第1天將小鼠隨機分成2組：實驗組［SElK，尾靜脈注射30 μg∕（200 μl·只）］，對照組（尾靜脈注射等體積PBS），每組4只，第5、10、5、20、25天分別注射PBS或SElK。第5天開始每5 d觀察腫瘤組織大小，計算腫瘤體積（mm3）=最長直徑×最短直徑2∕2，實驗結束時（第30天）處死小鼠，分離腫瘤組織，拍照并稱重。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用Dunnett檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SElK對T淋巴細胞亞型增殖的影響SElK（1 μg∕ml）可顯著刺激小鼠脾淋巴細胞CD4+和CD8+T淋巴細胞增殖，與對照組相比，SElK刺激后可顯著促進小鼠脾淋巴細胞CD4+和CD8+T淋巴細胞增殖，二者百分比分別提高1.40倍（P＜0.05）和1.25倍（P＜0.01，圖1A、B）。

2.2 SElK顯著刺激小鼠脾淋巴細胞中相關細胞因子表達qPCR法檢測SElK體外刺激小鼠脾淋巴細胞48 h后，脾淋巴細胞中IFN-γ、顆粒酶A和B基因表達量顯著升高，細胞毒性T淋巴細胞標志物顆粒酶A和B表達變化更為顯著（P＜0.01，圖1C）。

圖1 SElK對小鼠T淋巴細胞的活化作用Fig.1 Effect of SElK on mouse derived T lymphocytes ac?tivation

2.3 SElK對小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測SElK刺激48 h后小鼠脾淋巴細胞凋亡情況，不同濃度SElK（0.1、1.0和10 μg∕ml）刺激組與未刺激組均呈現明顯凋亡現象，但與未刺激組相比，不同濃度SElK處理組中淋巴細胞早期凋亡比例變化無統計學意義，晚期凋亡比例明顯降低（P＜0.01），正常活細胞比例顯著提高（P＜0.01，圖2）。表明SElK可顯著激活脾淋巴細胞并維持其活性，進而延緩細胞凋亡。

圖2 流式細胞術檢測SElK刺激小鼠脾淋巴細胞48 h后細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of splenic lymphocytes stimulated by SElK for 48 h were analyzed by flow cytometry

2.4 SElK體外刺激人T淋巴細胞中Vβ的表達譜 根據目前已建立的qPCR法檢測SElK體外刺激人PBMCs特異性Vβ T淋巴細胞的增殖譜，結果顯示，與對照組相比，SElK可激活攜帶TCR Vβ5（P＜0.01）、TCR Vβ17（P＜0.05）和TCR Vβ20（P＜0.05）亞群的T淋巴細胞，攜帶TCR Vβ5的T淋巴細胞最為顯著（圖3）。

圖3 SElK激活人PBMCs特異性TCR Vβ譜Fig.3 SELK activates TCR Vβ spectrum specific to hu?man PBMCs

2.5 SElK體外顯著抑制腫瘤生長 采用MTT法檢測SElK對BT474和A431腫瘤細胞生長的抑制作用，結果顯示，與陰性對照組相比，SElK在體外刺激人PBMCs后對腫瘤細胞BT474及A431的殺傷作用較強，在體外具有顯著抗腫瘤活性（P＜0.01），腫瘤細胞生長抑制率為90%以上（圖4A）。

2.6 SElK體內顯著抑制腫瘤生長 為進一步檢測SElK的體內抑瘤活性，實驗周期內實時檢測腫瘤體積，結果表明自15 d起，各檢測時間節點SElK對小鼠腫瘤生長具有明顯抑制作用（圖4B，P＜0.01）。實驗周期結束時，分離小鼠腫瘤組織，可明顯觀察到SElK（30 μg∕只）處理組小鼠腫瘤組織較PBS對照組小鼠腫瘤組織縮小（圖4C）；重量檢測結果表明SElK（30 μg∕只）處理組小鼠體內腫瘤組織重量較PBS對照組小鼠腫瘤組織重量顯著降低（圖4D，P＜0.01）。

圖4 SElK體內外抗腫瘤活性檢測Fig.4 Antitumour effect of SElK in vitro and in vivo

3 討論

腫瘤嚴重威脅人類健康，盡管可通過手術、放化療等手段治療，但依然存在復發及轉移風險，現有抗腫瘤藥物不僅對腫瘤細胞具有殺傷作用，同時也會影響正常細胞功能和存活，具有嚴重副作用。傳統腫瘤治療方法的局限性促使研究者尋找新的替代療法，而通過免疫增強劑激活宿主自身免疫力具有廣闊前景。腫瘤免疫治療是利用自身免疫系統對惡性腫瘤細胞進行特異性殺傷，并盡可能地降低副作用，是繼化療和靶向治療后最具前景的腫瘤治療方法之一［15］。

SEs作為典型的細菌外毒素，早在1989年就已將該類能夠誘導極強免疫學活性的蛋白命名為超抗原［16］。而作為超抗原家族成員，SEs通過與MHCⅡ類分子和特定TCR Vβ鏈可變區結合，有效激活具有特異性TCR Vβ片段的T淋巴細胞，發揮潛在高效的抗腫瘤作用［17］。已有大量報道證實SEs具有較強的腫瘤治療潛力，并在基礎及臨床研究中證實SEs治療后可產生較強的抗腫瘤作用［18］。我國SEA、SEB和SEC2已被用作腫瘤治療的補充藥物成分。作為經典的超抗原，SEA可有效抑制黑色素瘤生長［19］；SEB在體外和體內都能激活T淋巴細胞抑制膀胱腫瘤細胞生長或將其直接殺滅［20］；SEC2一直被用作腫瘤治療的輔助藥物［21］。盡管SEs在腫瘤治療領域展現出較強的潛能，但其自身固有的腸毒性及致嘔毒性產生嚴重副作用，限制了其作為新型抗腫瘤制劑的應用，而致嘔吐毒性較低的SEls的發現為開發新型抗腫瘤制劑提供了候選藥物［22］。

因此，本研究重點分析SElK對T淋巴細胞的活化效果，并驗證其體內外抗腫瘤活性，進一步闡明SElK的超抗原特性，結果顯示，SElK刺激后小鼠脾淋巴細胞中CD4+T和CD8+T淋巴細胞百分比顯著上調，尤其是CD4+T淋巴細胞。作為輔助性T淋巴細胞，CD4+T淋巴細胞可引導免疫系統對腫瘤細胞的攻擊；而CD8+T淋巴細胞是誘導腫瘤細胞和病毒感染細胞死亡的細胞毒性T淋巴細胞的主要參與者，可直接殺滅腫瘤細胞［23］。qPCR檢測結果發現，SElK可顯著刺激人PBMCs中攜帶TCR Vβ5、17和20亞群的T淋巴細胞增殖。同時SEs激活的T淋巴細胞可分泌大量細胞因子，對腫瘤細胞殺傷至關重要［24］。本研究結果亦表明，SElK激活的小鼠脾淋巴細胞中，IFN-γ、顆粒酶A和B基因表達顯著增加，尤其是顆粒酶A和B基因表達呈劑量依賴性增加，與CD8+T淋巴細胞上調結果一致，表明SElK刺激后顯著增強細胞毒性T淋巴細胞活性。細胞凋亡實驗結果發現，與對照組相比，不同濃度SElK處理組中，盡管對淋巴細胞的早期凋亡無明顯影響，但可顯著降低晚期凋亡細胞比例，且活細胞比例顯著增加，表明SElK在淋巴細胞凋亡過程中可維持細胞活性進而減少淋巴細胞凋亡。體外實驗結果表明，SElK可通過促進T淋巴細胞活化和細胞因子釋放發揮其潛在抗腫瘤活性，因此，SElK激活的人PBMCs在體外對人腫瘤細胞BT474和A431生長具有強烈抑制作用，抑制率達90%以上。體內實驗結果表明，SElK在免疫系統正常的小鼠腫瘤模型中發揮較強的抗腫瘤作用，SElK治療后可顯著抑制腫瘤生長。但SElK治療后尚未完全殺死腫瘤細胞，小鼠體內腫瘤仍在繼續生長，表明臨床上SElK與放化療聯用可能抗腫瘤效果更佳。

綜上，本研究表明，SElK可顯著促進T淋巴細胞活化，并釋放大量細胞因子，最終誘導其體內外較強的抗腫瘤活性，豐富了對SElK超抗原特性的認識，同時也為其在臨床腫瘤免疫治療中的應用提供理論依據。