miR-146b-5p靶向ZNRF2影響IL-17a誘導乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

王 娜 龔莉莉 葉春梅（武漢市婦女兒童醫療保健中心乳腺外科，武漢430014）

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤，其異質性和轉移性導致患者死亡率居高不下［1］。研究乳腺癌發生和轉移的機制，對其精準治療具有重要意義。

研究表明，IL-17a（interleukin-17a）在部分乳腺浸潤性導管癌組織中高表達，體外可促進乳腺癌MCF-7細胞的侵襲［2］。IL-17在乳腺癌血清樣本中高表達，可促進乳腺癌進展［3］。miR-146在乳腺癌患者中表達下調并與乳腺癌的發生和惡化有關［4］，miR-146b-5可通過靶向抑制IL-6表達抑制乳腺間質成纖維細胞的致癌作用［5］。ZNRF2與甲狀腺乳頭狀癌的發生有關［6］，參與miR-100抑制人骨肉瘤細胞增殖和耐藥過程［7］，且抑制ZNRF2表達可抑制非小細胞肺癌生長［8］。而ZNRF2在乳腺癌中的表達和作用尚不明確，其與miR-146b-5p和IL-17a在乳腺癌中是否存在關系還未可知。

本研究假設miR-146b-5p和ZNRF2參與IL-17a誘導乳腺癌進展的過程，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的研究靶點。

1 資料與方法

1.1 資料 選取本院病理科資料完整、診斷確切的女性乳腺癌手術切除癌癥組織20例和正常癌旁組織20例，患者年齡23～68歲，平均（45.4±9.6）歲，術前未進行放療、化療及免疫治療。人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國ATCC；DMEM高糖培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氮唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）購自美國Sigma-Aldrich公司；IL-17a抗體、ZNRF2抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司；引物、miR-146b-5p模擬物（miR-146b-5p）、miR-146b-5p抑制劑（anti-miR-146b-5p）、ZNRF2抑制物（si-ZNRF2）、陰性對照（miR-con、anti-miR-con、si-con）及雙熒光素酶ZNRF2突變和野生型載體購自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素報告基因檢測試劑盒酶購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉錄試劑盒（RTPCR）購自美國Invitrogen公司；real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化測乳腺癌組織和癌旁組織中的IL-17a將乳腺癌組織和癌旁組織于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，然后石蠟包埋、切片，按常規程序脫蠟和水化，再用3%H2O2滅活內源性過氧化物酶15 min，枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，10%血清37℃封閉30 min，加入1∶200的IL-17a一抗4℃孵育過夜，以PBS代替一抗作陰性對照，用PBS緩沖液沖洗3次×10 min，加入稀釋的二抗，37℃孵育30 min，洗3次，加DAB顯色液，避光顯色，終止顯色。蘇木素襯染胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37℃干燥48 h，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 細胞培養和IL-17a處理 細胞培養：配制含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養液，將乳腺癌細胞MDA-MB-231培養于上述配制好的培養液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。待細胞成長至對數生長期，用胰蛋白酶消化傳代。

IL-17a處理：用培養液稀釋對數生長期的MDAMB-231細 胞，以1×104個/孔 接 種于96孔板培 養24 h，然后在培養液中加入終濃度為0、10、50、100及300 μg/L的IL-17a，繼續培養24 h、48 h或72 h，進行后續實驗。對照組常規培養，培養液不添加IL-17a。

1.2.3 細胞轉染 將稀釋的MDA-MB-231細胞以2×105個/孔接種于6孔板，培養至細胞融合度為80%～90%時進行轉染。根據轉染試劑盒說明書操作，將無血清OptiMEM培養液稀釋脂質體和各組片段及載體（包括miR-con、miR-146b-5p、anti-miRcon、anti-miR-146b-5p、si-ZNRF2、si-con、雙熒光素酶報告系統載體），將稀釋的脂質體和各組載體片段等體積輕柔混勻，室溫孵育20 min后加入培養好的MDA-MB-231細胞中，混勻后培養6 h后，換成DMEM高糖完全培養基，轉染48 h，收集細胞，驗證轉染效果。

1.2.4 Real-time PCR檢 測miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA表達 收集IL-17a處理后的對數生長期的MDA-MB-231細胞，根據RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，按照反轉錄PCR試劑盒操作要求進行cDNA合成，再以cDNA為模板按照real-time PCR說明書進行反應，合成miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA。反應程序為：95℃2 min；94℃30 s、58℃40 s、72℃40 s，35個循環；72℃10 min。以2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.5 Western blot收集各組實驗MDA-MB-231細胞，裂解細胞，收集蛋白并檢測濃度。進行SDS-PAGE分離蛋白，轉PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗，ZNRF2抗體（1∶2 000）、MMP-2抗體（1∶1 500）、抗MMP-9抗體（1∶1 000）、STAT3抗體（1∶5 000）、p-STAT3抗體（1∶2 000）和抗β-actin抗體（1∶3 000），4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯影。以β-actin為內參照，分析蛋白表達水平。

1.2.6 MTT測定細胞活性 按照1.2.2的方法對MDA-MB-231細胞進行IL-17a處理，分別在培養至24 h、48 h、72 h時，每孔加入20 μl MTT溶液，培養4 h，棄上清，每孔再加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀測定OD490nm處吸光度（A）值。

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

1.2.7.1 遷移實驗 將MDA-MB-231細胞培養至對數生長期，用無血清DMEM培養液稀釋細胞至5×105個/ml。在Transwell上層加入100 μl稀釋好的細胞，下層小室加入500 μl含10%FBS和IL-17a終濃度為100 μg/L的DMEM高糖培養基，培養72 h，棄去培養液，用棉簽拭去上層小室未遷移的細胞，甲醛固定遷移的細胞30 min，結晶紫染色30 min，顯微鏡觀察并計數遷移細胞。

1.2.7.2 侵襲實驗 將Matrigel用4℃無血清培養基以1∶10比例稀釋，加入上層小室，37℃烘干3 h，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μl細胞，下層加入含10%FBS和IL-17a終濃度為100 μg/L的培養基，培養72 h，固定細胞，染色，計數。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗 將培養好的MDAMB-231細胞按照1.2.3步驟進行轉染，將構建好的ZNRF2野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報告載體分別與miR-con或miR-146b-5p共轉染至培養好的細胞，轉染48 h，收集細胞，驗證轉染效果，RIPA裂解液室溫裂解轉染后的細胞20 min，離心收集裂解上清，以海腎熒光素酶活性為內參照，計算螢火蟲熒光素相對酶活性。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，數據均以±s表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-17a在乳腺癌患者組織中高表達 檢測20例乳腺癌腫瘤組織和癌旁組織，結果表明，與癌旁組織相比，在大多乳腺癌腫瘤組織中IL-17a的表達呈陽性（P＜0.05），見圖1。說明IL-17在乳腺癌組織中高表達。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織中IL-17的表達（免疫組化染色，×200）Fig.1 Expression of IL-17 in breast carcinoma tissue and adjacent tissues（IHC staining，×200）

2.2 IL-17a處理促進乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和轉移 分別用終濃度為0、10、50、100和300 μg/L的IL-17a處理乳腺癌MDA-MB-231細胞株。結果表明，與對照組（0 μg/L）相比，經IL-17a處理后MDA-MB-231細胞增殖活性在48 h和72 h均明顯升高（P＜0.05），遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯增多（P＜0.05），且呈劑量依賴趨勢。說明IL-17a可促進MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲。根據實驗結果和經濟原則，后續實驗選擇100 μg/L的IL-17a處理細胞72 h（圖2）。

圖2 IL-17a處理促進乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲Fig.2 IL-17a treatment promoted proliferation，migration and invasion of breast cancer cell line MDAMB-231

2.3 IL-17a處理MDA-MB-231細胞抑制miR-146b-5p表達，促進ZNRF2表達 與對照組相比，IL-17a處理后MDA-MB-231細胞中miR-146b-5p的表達量明顯降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白和mRNA表達量均明顯升高（P＜0.05），遷移侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達量明顯升高（P＜0.05）。說明IL-17a處理MDAMB-231細胞可抑制細胞中miR-146b-5p表達并促進ZNRF2的表達（圖3）。

圖3 IL-17a處理MDA-MB-231細胞對miR-146b-5p、ZNRF2、MMP-2和MMP-9含量的影響Fig.3 Effects of IL-17a treatment on levels of miR-146b-5p，ZNRF2，MMP-2 and MMP-9 in MDA-MB-231 cells

2.4 miR-146b-5p靶向調控ZNRF2 ZNRF2的3'-UTR序列中含有與miR-146b-5p互補的核苷酸序列，見圖4A。雙熒光素酶報告系統結果如圖4B所示，過表達miR-146b-5p時，WT型ZNRF2螢火蟲熒光素酶相對活性明顯降低（P＜0.05）；而MUT型ZN-RF2的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化。Western blot結果表明，過表達miR-146b-5p時ZNRF2蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）；抑制miR-146b-5p表達時ZNRF2蛋白表達量明顯升高（P＜0.05），見圖4C。

經檢測，與癌旁組織相比，在20例乳腺癌組織中，miR-146b-5p含量明顯降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白含量明顯升高（P＜0.05），IL-17a表達量與miR-146b-5p呈負相關，miR-146b-5p與ZNRF2含量呈負相關，見圖4D～G。

2.5 IL-17a可逆轉過表達miR-146b-5p對MDAMB-231細胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號通路的影響 結果顯示，與Control組相比，IL-17a組MDAMB-231細胞增殖活性、遷移和侵襲數及細胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達升高，磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達升高；與Control組或miR-con組相比，miR-146b-5p組MDA-MB-231細胞增殖活性、遷移和侵襲細胞數及細胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達降低（P＜0.05）；與miR-146b-5p組 相 比，IL-17a+miR-146b-5p組MDA-MB-231細胞增殖活性、遷移和侵襲細胞數及細胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達升高（P＜0.05），見圖5。說明IL-17a可逆轉過表達miR-146b-5p對MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲及STAT3信號通路的抑制作用。

圖5 IL-17a可逆轉過表達miR-146b-5p對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.6 IL-17a可逆轉沉默ZNRF2對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號通路的影響 結果顯示，與si-con組相比，si-ZNRF2組MDA-MB-231細胞增殖活性、遷移和侵襲細胞及細胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達量降低（P＜0.05）；與si-ZNRF2組相比，si-ZNRF2+IL-17a組MDA-MB-231細胞增殖活性、遷移和侵襲細胞及細胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表達升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表達增加（P＜0.05），見圖6。說明IL-17a可逆轉沉默ZNRF2對MDAMB-231細胞增殖、遷移、侵襲及STAT3信號通路的抑制作用。

圖6 IL-17a可逆轉沉默ZNRF2對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲及STAT3信號通路的影響Fig.6 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on STAT3 signaling pathway of MDA-MB-231 cells

3 討論

IL-17由Th17細胞產生，可誘導細胞產生炎癥效應物和抗微生物蛋白等因子，參與免疫性疾病和炎癥的發生。近年研究表明，IL-17也在腫瘤中發揮促癌或抗癌效應［9-10］。IL-17a是IL-17家族成員之一，其單核苷酸多態性（SNPs）與中國女性患乳腺癌風險有關［11］，而IL-17與乳腺癌的侵襲和轉移有關［12-13］。本研究結果發現，IL-17a在乳腺癌組織中呈陽性表達，IL-17a可在體外抑制乳腺癌細胞MDAMB-231的增殖、遷移和侵襲，與相關報道結果一致［14］，表明IL-17a可促進乳腺癌的發生發展。

miRNA是一類小分子非編碼RNA，在真核生物體內廣泛存在，參與調控細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學過程，在癌癥的發生發展中發揮重要作用［15］。研究顯示，上調miR-146b-5p通過靶向抑制MMP-16表達降低腎癌細胞的增殖和侵襲能力［16］。姜黃素可通過上調miR-146b-5p表達抑制乳腺癌細胞轉移，誘導細胞凋亡［17］。本研究結果表明，在乳腺癌組織中miR-146b-5p表達水平下降，過表達miR-146b-5p可抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲，與相關報道結果一致，表明miR-146b-5p作為抑癌基因參與乳腺癌的發生發展過程，是乳腺癌治療的潛在分子靶點［18］。本研究還顯示，IL-17a可抑制MDA-MB-231細胞中miR-146b-5p表達，過表達miR-146b-5p可降低IL-17a對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用，與肖慶等［19］報道的IL-17a通過抑制miR-195-5p表達促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的結果一致。

生物信息學預測結果發現，ZNRF2的3'-UTR序列中含有與miR-146b-5p互補的核苷酸序列，miR-146b-5p可能靶向調控ZNRF2表達。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗和Western blot證實了miR-146b-5p在乳腺癌MDA-MB-231細胞中靶向負調控ZNRF2表達，這也與IL-17a抑制MDA-MB-231細胞中miR-146b-5p表達，促進ZNRF2表達的結果一致。ZNRF2是環超家族E3泛素連接酶，可與細胞膜上的哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）協同作用感知氨基酸供應和調節細胞生長，在多種癌癥中發揮作用［20］。但目前，ZNRF2在乳腺癌中的表達和作用尚不明確。本研究發現，ZNRF2在乳腺癌組織中表達上調，IL-17a可促進MDA-MB-231細胞中ZNRF2的表達，沉默ZNRF2可抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲，表明ZNRF2作為促癌基因參與乳腺癌的發生發展進程，靶向抑制其表達可延緩乳腺癌發展進程。

STAT3信號通路在多種惡性腫瘤中處于高度激活狀態，參與腫瘤細胞的增殖和侵襲過程，如膀胱癌、肺癌［21-22］。本研究顯示，IL-17a可激活乳腺癌細胞中STAT3信號通路，與相關報道結果一致［23］。本研究還顯示，過表達miR-146b-5p或沉默ZNRF2可抑制IL-17a對乳腺癌細胞中STAT3信號通路的激活作用，進一步表明過表達miR-146b-5p可能通過負調控ZNRF2抑制STAT3信號通路的激活從而降低IL-17a對乳腺癌細胞惡性生物學行為的影響。

綜上所述，IL-17a可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，過表達miR-146b-5p可通過靶向抑制ZNRF2表達降低IL-17a對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。