基于動物模型篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及鑒定方法

毛玉寧郭文文趙菊梅*師長宏*

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,西安 710032)

全球每年新發(fā)胃癌人數(shù)約有95萬,死亡近70萬,是危害最嚴重的腫瘤之一[1]。胃癌發(fā)病早期臨床癥狀不明顯,就診時可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,預(yù)后不良,是造成胃癌死亡率高的重要原因之一,因此在胃癌診斷和治療中需要一些轉(zhuǎn)移相關(guān)標志物,以提高診斷的精確性,指導(dǎo)針對性治療。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,開展轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究有利于及時發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移、篩選新的標志物和治療靶點,從而提高患者的生存率。利用動物模型篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,充分模擬體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程,轉(zhuǎn)移效率高,表型特征明確,具有較好的臨床相似性。本文就篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的動物模型、監(jiān)測動物模型中腫瘤轉(zhuǎn)移的方法及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能鑒定進行綜述,以期為胃癌轉(zhuǎn)移機制研究和篩選新的治療靶點提供有效的實驗工具。

1 基于動物模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

1.1 利用細胞異種移植模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

細胞異種移植(cell line derived xenograft,CDX)模型是指將培養(yǎng)的腫瘤細胞移植到免疫缺陷小鼠構(gòu)建的腫瘤模型。CDX模型所用細胞系是經(jīng)過多代體外培養(yǎng),其生物學(xué)特征變化明顯,部分適應(yīng)體外培養(yǎng)、具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞系被篩選出來,易于獲得轉(zhuǎn)移模型。CDX模型的建立可以通過皮下注射、腹腔注射、尾靜脈注射等方式實現(xiàn)。Zhu等[2]通過裸鼠后肢皮下注射胃癌細胞系BGC-823建立了異種移植模型,發(fā)現(xiàn)miR-106a有通過靶向Smad7促進腫瘤生長的潛力,同時發(fā)現(xiàn)miR-106a與胃癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)胃泌素水平與胃癌發(fā)展密切相關(guān),Zu等[3]通過裸鼠皮下注射人胃癌細胞系SGC-7901成功建立細胞異種移植模型,發(fā)現(xiàn)胃泌素可以通過激活ERK-P65-miR23a/27a/24軸抑制低分化胃癌細胞的增殖并增強順鉑對胃癌的抑制作用。建立CDX模型時也可使用帶有生物酶標記的腫瘤細胞,有助于動態(tài)監(jiān)測體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移情況,為轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選提供便利。Miwa等[4]用穩(wěn)定表達熒光素酶的MKN1(MKN1-luc)和MKN45(MKN45-luc)胃癌細胞以及N87、KATO III、NUGC4、OCUM-1胃癌細胞注射裸鼠腹腔成功建立腹腔轉(zhuǎn)移模型,通過將MKN1-Luc和MKN45-Luc直接注射到小鼠門靜脈成功建立了肝轉(zhuǎn)移模型。

由于建立CDX模型使用的是傳代細胞系,缺乏人體內(nèi)腫瘤生長的微環(huán)境,因此不能很好的模擬人體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移情況?；颊咴葱阅[瘤細胞(patient-derived cell models,PDC)模型其所用細胞是從患者腹水、胸腔積液等惡性積液中分離出的患者源性腫瘤細胞,因此更能反映患者的個體化特征,在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選和臨床藥物篩選方面體現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。Lee等[5]用從轉(zhuǎn)移癌患者收集的細胞建立了PDC模型,研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤與子代PDC模型的基因組改變高度一致,平均變異等位基因頻率相關(guān)性為0.878,進一步比較了原發(fā)腫瘤P0、P1、P2細胞的基因組特征,發(fā)現(xiàn)三個樣本(P0、P1和P2細胞)高度相關(guān),且該模型的藥物反應(yīng)體現(xiàn)了患者對靶向藥物的臨床反應(yīng)。通過轉(zhuǎn)移患者源性腫瘤細胞建立的PDC模型雖然能反映患者的個體化特征,但其是在體外培養(yǎng),培養(yǎng)難度大且不能模擬體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移過程,因此用該模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的使用受限。通過上述CDX模型和PDC模型篩選出的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有利于發(fā)現(xiàn)促進胃癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子,為臨床及早發(fā)現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移提供幫助。

1.2 利用患者源性異種移植模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

患者源性異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型改善了CDX模型和PDC模型的不足,是目前篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因較好的模型。該模型是將臨床新鮮的手術(shù)標本移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的異種移植模型,其保持了原發(fā)腫瘤生長的微環(huán)境,因此更能模擬體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)行為。PDX模型較好的保留了患者腫瘤的組織學(xué)、基因組、細胞異質(zhì)性和藥物反應(yīng)特性,可以通過整合臨床數(shù)據(jù)、基因組資料和藥物反應(yīng)性數(shù)據(jù)來指導(dǎo)靶向治療,應(yīng)用于個性化藥物選擇、生物標志物的開發(fā)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[6]。PDX模型較好地保留了患者腫瘤組織學(xué)及基因組特征,便于利用該類模型對胃癌發(fā)生發(fā)展過程進行分析研究。Choi等[7]成功建立了15例胃癌PDX模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤模型的組織學(xué)和遺傳特征在隨后的傳代中保持穩(wěn)定,并與原發(fā)腫瘤高度一致,這一發(fā)現(xiàn)使利用PDX模型進行胃癌發(fā)展機制的分子研究和個體化治療成為可能。PDX模型與原發(fā)腫瘤具有相對一致的基因組學(xué)特征,這非常有利于個體化轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選。Zhang等[8]成功建立了32個胃癌PDX模型,發(fā)現(xiàn)FGFR2、MET、ERBB2的基因擴增在PDX模型和它們的親本腫瘤之間相似程度很高,PTEN與MET蛋白表達也呈中度一致,這些數(shù)據(jù)為個體化治療的體內(nèi)測試和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選提供理論基礎(chǔ)。建立PDX模型時組織移植的方法有很多,包括皮下移植、腎包膜移植、原位移植等,其中皮下移植是最常用的移植方式。Guo等[9]通過皮下移植建立胃癌PDX模型,揭示了ISL1通過結(jié)合ZEB1啟動子和輔助因子SETD7促進胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制,ISL1可能是胃癌潛在的預(yù)后標志物。由于原位移植瘤所處的微環(huán)境更接近于人體環(huán)境,因此原位移植較皮下移植更能模擬人體內(nèi)腫瘤的生長情況,更容易模擬臨床發(fā)生轉(zhuǎn)移,有利于篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。王潔等[10]通過皮下移植建立14例胃癌PDX模型,但均未發(fā)生轉(zhuǎn)移,進一步原位移植成功建立3例胃癌PDX模型,其中C19751發(fā)生肝和肺的轉(zhuǎn)移,通過PCR-Array分析顯示與原發(fā)瘤比較有三個基因表達顯著上調(diào),包括趨化因子CXCL12、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)。PDX模型含有的患者基質(zhì)成分會隨著傳代數(shù)的增加而發(fā)生變化[11],因此在利用PDX模型作為臨床前研究模型時,低代次的PDX模型更能反映患者的個體化特征,更有利于轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究?？傊?PDX模型能較好的保留患者腫瘤的基因組特征,關(guān)鍵基因的表達與患者腫瘤較一致,為PDX模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因提供理論依據(jù)。

2 轉(zhuǎn)移動物模型的檢測

及時、準確的檢測轉(zhuǎn)移的發(fā)生對于腫瘤模型的研究非常重要,目前檢測腫瘤轉(zhuǎn)移的方法主要有ALU-PCR、生物熒光成像的可視化患者來源原位移植轉(zhuǎn)移瘤模型(imageable patient-derived orthotopic xenograft,iPDOX)、近紅外熒光(near infrared fluorescence,NIRF)。ALU的檢測需要處死動物,而NIRF和iPDOX技術(shù)可以通過成像系統(tǒng)無損傷并動態(tài)的監(jiān)測動物模型中腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。

ALU-PCR是一種非常靈敏的檢測技術(shù),可以從不同來源基因組DNA樣品中特異性的擴增出人的ALU基因序列。由于ALU家族是基因組中的一種重復(fù)序列且僅存于靈長類基因組,小鼠體內(nèi)組織中并不存在,因此當(dāng)動物腫瘤模型發(fā)生轉(zhuǎn)移時可以通過PCR檢測ALU基因表達情況,從而評估各組織臟器的轉(zhuǎn)移程度。同時ALU在原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤中的表達也存在差異,Schneider等[12]通過AIU-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的6例病例中,有5例(83%)發(fā)現(xiàn)了具有信息性的等位基因帶型,而在肺外轉(zhuǎn)移的14例病例中,有9例(64%)發(fā)現(xiàn)了等位基因帶型,與正常肺組織或原發(fā)性肺腫瘤組織相比,轉(zhuǎn)移瘤細胞中檢測到了多種基因組變化。該方法評估轉(zhuǎn)移具有創(chuàng)傷性,需要在處死荷瘤鼠后取其組織檢測,因此使用受限。

iPDOX是通過病人腫瘤組織建立的原位移植小鼠模型,該模型可以復(fù)制患者腫瘤生物學(xué)行為,包括轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡等。iPDOX可以通過活體熒光成像系統(tǒng)對原位移植瘤的生長、轉(zhuǎn)移進行動態(tài)監(jiān)測,實時動態(tài)的觀察腫瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移情況。Kawaguchi等[13]在廣泛表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因裸鼠中培養(yǎng)患者胃平滑肌肉瘤,以穩(wěn)定標記腫瘤間質(zhì),建立了可成像的PDOX(iPDOX)模型。雖然該模型可以直接觀察到腫瘤的轉(zhuǎn)移,但模型建立過程繁瑣、需要特異性工具鼠、實驗周期長、成本較高,目前在篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因方面應(yīng)用較少。

聚甲基川菁染料是一類具有腫瘤靶向性的近紅外熒光(near-infrared fluorescence,NIRF)染料,該染料熒光背景低、組織穿透能力強,可用于腫瘤模型的活體成像。研究發(fā)現(xiàn)七甲川花菁類NIRF染料不僅具有成像功能還可以特異性的識別腫瘤細胞,這種識別與HIF1α/OATPs信號分子的活化密切相關(guān),因為大部分腫瘤組織內(nèi)存在缺氧和OATP的高表達,所以該類染料可以在腫瘤細胞內(nèi)特異性集聚,可用于監(jiān)測體內(nèi)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況[14]。趙寧寧等[15]研究發(fā)現(xiàn)NIRF染料IR-783可以特異性識別胃癌腫瘤細胞和胃癌PDX移植瘤,這使得動態(tài)監(jiān)測胃癌PDX模型的轉(zhuǎn)移成為可能,為通過PDX模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因提供技術(shù)支持。

3 篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因方法

成功建立動物模型并檢測到轉(zhuǎn)移后,提取原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的RNA或者DNA進行轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選。常用的篩選方式包括微陣列分析以及PCR陣列。微陣列分析可以同時將大量探針固定于支持物上,一次性對樣品大量序列進行檢測,因此解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、檢測序列數(shù)量少、檢測效率低等問題,Wang等[16]通過陣列分析發(fā)現(xiàn)有28個miRNAs在浸潤型胃癌中有差異表達,在這28個miRNA中,miR-29b是下調(diào)最顯著的miRNA之一,miR-29b通過與MMP2的miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element,MRE)結(jié)合負調(diào)控MMP2,進而影響胃癌的發(fā)展。PCR Array(又稱PCR陣列)是目前研究基因表達的首選技術(shù),該技術(shù)在微陣列高通量的基礎(chǔ)上結(jié)合PCR的高靈敏度和特異性,可以更加快速、準確的反映基因表達情況。Sandoval等[17]對轉(zhuǎn)染了miR-335的細胞進行PCR陣列檢測,發(fā)現(xiàn)在參與胃癌轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲的62個基因中,有19個(30.6%)的轉(zhuǎn)錄水平下降,進一步網(wǎng)絡(luò)富集分析將這些基因縮小到9個(PLAUR、CDH11、COL4A2、CTGF、CTSK、MMP7、PDGFA、TIMP1、TIMP2)。

4 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能鑒定方法

篩選出胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因后,可進一步通過體內(nèi)和體外實驗來鑒定轉(zhuǎn)移基因?qū)τ谖赴┌l(fā)生發(fā)展的影響。

4.1 體內(nèi)實驗

胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因體內(nèi)鑒定實驗主要是通過構(gòu)建敲低或敲高目的基因的胃癌細胞株后,將其注射到小鼠體內(nèi)建立CDX模型,觀察目的基因的表達變化對于腫瘤的影響。Ding等[18]將CTHRC1 siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株后,通過嘌呤霉素持續(xù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,發(fā)現(xiàn)siRNA降低CTHRC1表達后胃癌細胞的遷移和侵襲能力下降。Gao等[19]為了探討NEAT1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用,建立了NEAT1低表達和過表達胃癌細胞株,RTqPCR確認si-NEAT1加入后顯著降低了胃癌細胞中NEAT1的表達,進一步研究發(fā)現(xiàn)NEAT1促進胃癌細胞遷移及侵襲,并與患者較差的生存率相關(guān)。已報道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因可以通過不同的途徑影響胃癌細胞,主要包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]、RUNX3[21]、CMYC[22]信號通路等。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是影響胃癌發(fā)生發(fā)展的主要因素之一,Chen等[23]通過研究發(fā)現(xiàn)異核核糖核酸蛋白A1(hnRNPA1)在體內(nèi)外均促進了胃癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,將高表達hnRNPA1的細胞株經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)hnRNPA1高表達可顯著誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,并促進肺轉(zhuǎn)移。Zhang等[24]通過小鼠腹腔注射轉(zhuǎn)染過表達SALL4(鋅指轉(zhuǎn)錄因子)和沉默SALL4的穩(wěn)定細胞株建立CDX模型,發(fā)現(xiàn)SALL4低表達抑制了體內(nèi)腫瘤的生長,而SALL4的過表達促進體內(nèi)腫瘤的生長,進一步研究發(fā)現(xiàn)SALL4通過激活TgF-akt/sMaD信號通路,誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進胃癌轉(zhuǎn)移。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)與胃癌細胞的增殖和侵襲密切相關(guān),Song等[25]給胃癌荷瘤鼠分別注射miR-17-5p激動劑和拮抗劑,發(fā)現(xiàn)miR-17-5p激動劑可顯著促進體內(nèi)腫瘤的生長。C-MYC和TGF-CADT信號通路與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),Xu等[26]將低表達環(huán)狀RNA CCDC66的SGC-7901細胞皮下注射至小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)腫瘤生長緩慢,進一步研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA CCDC66通過調(diào)節(jié)C-MYC和TGF-CADT信號通路促進胃癌進展,并有可能成為胃癌轉(zhuǎn)移的生物標志物。上述體內(nèi)實驗?zāi)茌^好的反映基因在體內(nèi)對于腫瘤的影響,對于研究基因的功能非常必要(表1)。

表1 影響胃癌轉(zhuǎn)移的主要基因和信號通路舉例(體內(nèi)鑒定)Table 1 Examples of major genes and signaling pathways that influence metastasis of gastric cancer(Identification in vivo)

4.2 體外實驗

體外鑒定轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能的實驗主要包括傷口愈合實驗、Transwell實驗、集落形成實驗、細胞增殖實驗、流式檢測細胞周期及細胞凋亡實驗等。傷口愈合和Transwell實驗都可以檢測細胞的遷移能力,后者也可檢測細胞侵襲能力。Liu等[27]通過傷口愈合實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)高表達DCLK1的胃癌細胞遷移和侵襲明顯增強,SNHG1通過DCLK1介導(dǎo)的Notch1通路增強胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,從而促進胃癌發(fā)展。已證實長鏈非編碼RNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),Shuai等[28]通過傷口愈合和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達MNX1-AS1可顯著促進胃癌細胞的遷移和侵襲,而降低MNX1-AS1表達則產(chǎn)生相反的作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1通過抑制BTG2和上調(diào)BCL2的表達促進胃癌發(fā)展。也有一些基因通過影響細胞周期及細胞凋亡進而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展,因此通過流式分析細胞周期及凋亡可以驗證轉(zhuǎn)移基因功能。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)在敲除HOXC-AS3基因后,胃癌細胞在G1-G0期顯著停滯,下調(diào)HOXC-AS3后胃癌細胞凋亡明顯增加,異常組蛋白修飾激活的HOXC-AS3在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用,并可能作為胃癌診斷和治療的靶點。細胞增殖實驗和集落形成實驗可以檢測腫瘤細胞的增殖能力,Wang等[30]人發(fā)現(xiàn)MDGA2可以顯著抑制胃癌細胞增殖及菌落形成,MDGA2的抗腫瘤作用通過直接穩(wěn)定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白1(DMAP1)實現(xiàn)。上述體外實驗周期短、操作簡單、影響因素少,是轉(zhuǎn)移基因功能鑒定中不可缺少的環(huán)節(jié)。但體外實驗類型較多,在選擇體外鑒定實驗時應(yīng)關(guān)注目的基因?qū)τ谀[瘤細胞能力影響方面均選取相應(yīng)的實驗,例如,可分別選擇增殖、凋亡、遷移和侵襲能力檢測等(表2)。

表2 影響胃癌轉(zhuǎn)移的主要基因和信號通路舉例(體外鑒定)Table 2 Examples of major genes and signaling pathways affected by metastasis-related genes in gastric cancer(Identification in vitro)

5 展望

成功建立高保真的PDX模型和CDX模型為胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選奠定了良好基礎(chǔ),但如何模擬人體微環(huán)境促發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移是急需解決的問題。近年來,人源化小鼠模型和斑馬魚模型的開發(fā)為篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因增添了新的實驗工具。通過重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠移植人的PBMC或CD34+造血干細胞構(gòu)建的人源化小鼠模型,可以更好的模擬在人體免疫系統(tǒng)存在下腫瘤細胞的遷移能力、侵襲能力、轉(zhuǎn)移特性[31],但該類模型構(gòu)建周期長、實驗過程繁瑣、影響因素多,經(jīng)濟成本高。斑馬魚模型近年來也成為一種重要的腫瘤生物模型,斑馬魚在早期沒有免疫力,移植入腫瘤細胞后成瘤性較好,轉(zhuǎn)移性強,同時斑馬魚模型易于觀察、實驗周期短、費用較低。Wu等[32]將兩株人胃癌細胞(AGS和SGC-7901)以及14個人胃癌組織原代細胞異種移植到斑馬魚胚胎中,建立基于斑馬魚胚胎的異種移植模型,其中有9例移植成功,并在活胚胎中顯示出增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移潛能,該模型有可能成為未來胃癌轉(zhuǎn)移研究的潛在實驗平臺?？傊?依據(jù)人體腫瘤轉(zhuǎn)移模型篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,能夠有效加快人們對于胃癌轉(zhuǎn)移分子機制的認識,便于發(fā)現(xiàn)更多轉(zhuǎn)移標志物及治療靶點,從而使大量的胃癌患者受益。