過氧化氫誘導大鼠離體子宮韌帶成纖維細胞的相關變化

卓然然,聶明朝,李麗紅,李常虹,張芳芳

(海南省婦女兒童醫學中心(海南省婦幼保健院)婦產科,海口 571100)

盆底功能障礙性疾病是中老年女性的常見病,主要是由于損傷、衰老等原因導致盆底組織結構發生病理改變,最終發生盆腔器官位置異常及相應器官功能障礙,是影響女性身心健康和生活質量的一個重要公共問題[1-2]。該病包括盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)和壓力性尿失禁。女性盆腔器官和盆底組織處于妊娠、分娩等引起腹內壓力變化的復雜生物力學環境中,容易損傷盆底肌肉筋膜及子宮韌帶,或因其他原因導致其張力減低,支持功能薄弱,使腔內器官下降移位,即為盆底器官脫垂[3-4]。有研究顯示,POP的發生還與氧化應激相關[5],Kim等[6]對盆底組織基因組多態性的研究發現,氧化應激相關基因與POP相關。

成纖維細胞是子宮韌帶的主要細胞,也是盆底韌帶的主要受力細胞,主要功能是合成并分泌細胞外基質等,以此促進機體的新陳代謝,支持組織結構和功能[7],其中Ⅰ型膠原與支持作用有關,硬度較大,直徑較粗,Ⅲ型膠原、彈性蛋白與組織的彈性有關,這些成分的變化導致彈性和拉伸強度降低,導致韌帶、筋膜等支持結構松弛[8-9]。正常機體存在抗氧化系統,當活性氧生成過量和(或)機體抗氧化系統受損導致活性氧及其代謝產物過量聚集時,氧化還原平衡失調,大量的活性氧簇就會產生氧化應激反應。過氧化氫是活性氧簇的主要成員之一,可通過多種途徑損害細胞,是一種比較常用的細胞氧化應激和細胞老化誘導劑[10-11]。本研究以子宮韌帶成纖維細胞為干預對象,用不同濃度過氧化氫刺激模擬氧化應激微環境,觀察氧化應激對大鼠子宮韌帶成纖維細胞增殖、凋亡、膠原合成以及炎癥因子表達的影響并探討其相關分子機制,為POP疾病治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4周齡雌性SD大鼠4只,SPF級,體重70~80 g,購買于湖南省斯萊克景達實驗動物公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養于海南省人民醫院實驗動物中心[SYXK(瓊)2019-0011],所有動物實驗程序均按國家標準進行并經海南省人民醫院動物實驗倫理委員會批準(HNWCMC倫審2019年第[7]號),并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

過氧化氫(H2O2)(天津科密歐化學試劑有限公司);DMEM培養基、胎牛血清、膠原酶(Gibco,美國);4%多聚甲醛、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國);MTT試劑、二甲基亞砜(上海碧云天生物有限公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);波形蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體、生物素化山羊抗大鼠IgG、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(武漢博士德生物工程有限公司);細胞裂解液、BCA蛋白含量檢測試劑盒(Sigma公司,美國);抗Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6、白細胞介素1β、p-ERK1/2、ERK1/2、Akt、p-Akt、GAPDH抗體、HRP標記的兔抗羊二抗(Santa Cruz Biotechnology公司,美國)。

CO2細胞培養箱(Therm Fisher公司,美國);倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);MK3酶標儀(Thermo公司,美國);流式細胞儀(BD公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 子宮韌帶成纖維細胞培養

將4周齡雌性SD大鼠頸椎脫臼處死后,無菌條件下取出雙側子宮韌帶組織,PBS清洗3~5遍,用剪刀剪成1 mm×1 mm左右的小塊,用含0.25%胰蛋白酶及0.2%Ⅱ型膠原酶的混合液消化2 h,體積分數為10%胎牛血清終止消化,1500 r/min離心洗滌5 min,棄上清,用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養基重懸,接種于培養瓶中,置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱內培養,每2 d換液1次,待細胞生長達到80%~90%時按1∶2比例進行傳代,取第3~5代細胞用于后續實驗。

1.3.2 成纖維細胞鑒定

選取生長狀況良好的第3~5代子宮韌帶成纖維細胞,制成每毫升2×105個的細胞懸液,以每孔1 mL接種于預先放有蓋玻片的6孔培養板中,倒置顯微鏡下觀察蓋玻片上的細胞增殖至70%~80%時進行檢測。取出玻片,PBS漂洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗3次×3 min;體積分數為3%H2O2孵育15 min,PBS漂洗3次×3 min;10%山羊血清封閉20 min,消除非特異性背景,吸去多余液體,不必清洗;加入抗角蛋白、抗波形蛋白單克隆抗體,4℃孵育過夜,PBS漂洗3次×3 min;滴加生物素化山羊抗大鼠IgG二抗室溫孵育20 min,PBS漂洗3次×3 min;然后加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物室溫孵育20 min,PBS漂洗3次×5 min;DAB顯色,顯微鏡下掌握染色程度,流水沖洗;蘇木精復染1 min,自來水沖洗返藍,鏡下觀察。

1.3.3 過氧化氫誘導子宮韌帶成纖維細胞氧化應激模型建立

據前期參考文獻[12],選擇0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫對子宮韌帶成纖維細胞干預4 h,建立細胞低水平和高水平的氧化應激模型,以正常培養未進行任何干預的子宮韌帶成纖維細胞作為對照組。

1.3.4 MTT法檢測細胞增殖能力

將第3代子宮韌帶成纖維細胞懸液以每孔2×105個的密度接種于96孔板,每孔100μL,細胞分3組:低氧化應激組用0.2 mmol/L過氧化氫干預4 h,高氧化應激組用0.8 mmol/L過氧化氫干預4 h,對照組單純采用DMEM完全培養基孵育4 h,然后每孔加入10μL MTT溶液(5 g/L),繼續培養4 h后吸棄上清,每孔加150μL DMSO溶液,振蕩10 min,使用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況

將第3代子宮韌帶成纖維細胞懸液以每孔1×105個細胞密度接種于6孔板,培養24 h后細胞分3組:低氧化應激組用0.2 mmol/L過氧化氫干預4 h,高氧化應激組用0.8 mmol/L過氧化氫干預4 h,對照組單純采用DMEM完全培養基孵育4 h,PBS洗滌2次,0.25%胰酶消化,離心收集細胞,加入500μL Binding Buffer結合緩沖液吹打混勻,然后依次加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,室溫避光孵育20 min,流式細胞儀上機檢測。

1.3.6 Western blot檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、炎癥因子、信號通路相關蛋白的表達

按上述分組干預4 h后收集細胞,PBS清洗2次,按比例加入細胞裂解液,研磨細胞,12000 r/min離心8 min,提取細胞總蛋白,采用BCA方法檢測蛋白濃度。取20μL蛋白樣品,加入適量濃縮的蛋白上樣緩沖液混合,100℃水浴中煮沸5 min使蛋白變性,冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到加樣孔內,100 V電壓下SDS-PAGE凝膠電泳分離90 min;然后將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜上,在100 V電壓下轉膜1 h;取出PVDF膜,用含5%脫脂奶粉封閉液放搖床上封閉1~3 h;加入一抗(抗Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6、白細胞介素1β、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt、Akt、GAPDH抗體)室溫孵育1 h后,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入HRP標記的兔抗羊二抗室溫孵育2 h,TBST清洗3次,加入ECL發光液反應5 min,曝光,顯影,用Image J軟件分析各組目的蛋白和內參蛋白條帶的灰度值,結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示。

1.4 統計學方法

各實驗重復3次,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析,檢測水平為α=0.05,樣本均數多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 子宮韌帶成纖維細胞形態及鑒定結果

細胞形態以梭形、紡錘形為主,胞體狹長,胞核呈橢圓形,胞漿豐富,細胞排列有一定的方向性。免疫細胞化學染色顯示:波形蛋白染色陽性,胞漿內見大量棕黃色顆粒,角蛋白染色陰性,符合成纖維細胞的細胞標記特征。見圖1。

圖1 子宮韌帶成纖維細胞形態及鑒定結果Note.A,Fibroblasts of the third generation of uterine ligament were long spindle shaped.B,Immunocytochemical staining showed that vimentin staining was positive.C,Keratin staining was negative.Figure 1 Morphology and identification results of fibroblasts from uterine ligament

2.2 氧化應激對子宮韌帶成纖維細胞增殖的影響

采用MTT法檢測細胞增殖能力,高氧化應激組吸光度值顯著低于低氧化應激組、對照組,差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預4 h后,細胞增殖能力下降,而低氧化應激組吸光度值與對照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 氧化應激對子宮韌帶成纖維細胞增殖的影響Note.Compared with the control group and low oxidative stress group,*P＜0.05.The same as below.Figure 2 Effect of oxidative stress on proliferation of fibroblasts from uterine ligament

2.3 氧化應激對子宮韌帶成纖維細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測高氧化應激組細胞凋亡率[(39.6±4.4)%]顯著高于低氧化應激組、對照組[(18.45±1.61)%,(12.12±1.06)%],差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預4 h后,細胞凋亡率明顯增高,而低氧化應激組細胞凋亡率與對照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測子宮韌帶成纖維細胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of fibroblasts in uterine ligament

2.4 氧化應激對子宮韌帶成纖維細胞膠原合成的影響

Western blot檢測高氧化應激組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達顯著低于低氧化應激組、對照組,差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預4 h后,Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原合成明顯減少,而低氧化應激組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達與對照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達Figure 4 Western blot was used to detect the expression of type I collagen and type III collagen in uterine ligament fibroblasts

2.5 氧化應激對子宮韌帶成纖維細胞炎癥因子蛋白表達的影響

Western blot檢測高氧化應激組白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的蛋白表達水平明顯高于低氧化應激組、對照組,差異有顯著性意義(P＜0.05);同時低氧化應激組白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的蛋白表達水平也輕微提高,但與對照組比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細胞炎癥因子蛋白的表達Figure 5 Western blot was used to detect the expression of inflammatory factor protein in fibroblasts of uterine ligament

2.6 Western blot檢測通路相關蛋白的表達

采用Western blot檢測MEK-ERK1/2與PI3KAkt信號通路相關蛋白的表達,結果顯示,與對照組和低氧化應激組相比,高氧化應激組p-ERK1/2、p-Akt的表達明顯降低(P＜0.05),而總蛋白ERK1/2、Akt的表達基本保持不變。見圖6。

圖6 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細胞通路相關蛋白的表達Figure 6 Western blot was used to detect the expression of fibroblast pathway related proteins in each group

3 討論

POP是一類由盆底支持結構功能障礙而引起的盆腔正常器官(陰道壁、子宮、膀胱、直腸等)位置下移,從而嚴重影響人們的身體健康及生活質量的常見疾病。年齡、陰道分娩、慢性便秘、肥胖和激素水平下降是公認的危險因素,隨著年齡的增長,分娩的影響逐漸降低,而衰老、激素水平改變的影響則明顯增加[13-14]。根據衰老自由基理論[15],細胞衰老在某種意義上是氧化損傷的結果。研究顯示導致氧化應激損傷的活性氧不僅能誘導細胞發生凋亡,還能激活細胞使其具有表型轉化的潛能[16-17]。過氧化氫是活性氧的一種,也是體內導致氧化應激損傷的主要效應分子,其參與調節新陳代謝、老年性疾病、凋亡和生長因子相關的信號通路,盡管其本身會迅速與信號分子反應而失活,但其造成級聯反應能導致氧化應激持續存在,使其成為氧化應激研究的重要工具藥[18]。過氧化氫介導的氧化應激在POP疾病進展過程中可能發揮著重要作用。課題組前期用不同濃度過氧化氫干預后發現子宮旁韌帶成纖維細胞內活性氧水平增高,使細胞處于氧化應激狀態,且具有一定的劑量依賴性,認為0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫可導致細胞低水平氧化應激和高水平氧化應激[12]。在此基礎上,該實驗選取0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫誘導大鼠子宮韌帶成纖維細胞氧化應激產生,初步觀察不同程度氧化應激作用下大鼠子宮韌帶成纖維細胞增殖、凋亡、膠原合成以及炎癥因子表達并探討其相關分子機制。本研究采用MTT法和Annexin V-FITC/PI法檢測細胞增殖、凋亡情況,結果顯示:低水平氧化應激狀態下細胞內活性氧雖有增多,細胞活力有所下降,細胞凋亡有所增加,但與對照組比較差異無顯著性意義,說明其不足以影響細胞發揮正常功能;但隨著活性氧產生繼續增加,細胞氧化應激水平也增加,細胞活力明顯下降,細胞凋亡進一步增加,與對照組和低氧化應激組比較差異有顯著性意義,說明高濃度的過氧化氫能明顯抑制子宮韌帶成纖維細胞增殖,誘導細胞凋亡。

以往研究表明,以膠原合成減少為特征的細胞外基質代謝紊亂是POP的病理分子基礎[19]。膠原蛋白是一組由多種糖分子組成的大家族,是細胞外基質的一種結構蛋白質。不同類型的膠原蛋白有著不同的化學結構,相應的具有不同功能和免疫學特性。盆底的筋膜和韌帶膠原蛋白主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構成,Ⅰ型膠原蛋白直徑較粗,有很高的抗張強度,對盆腔器官起支持作用;Ⅲ型膠原蛋白直徑較細,與彈性有關。Jackson等[20]發現POP患者陰道組織膠原含量減少20%;Lang等[21]報道壓力性尿失禁和POP患者子宮韌帶膠原纖維直徑明顯大于對照組,這些韌帶彈性較小,更容易斷裂,以膠原降解占主導作用可能是發生壓力性尿失禁和POP的原因之一;Han等[22]研究發現POP伴或不伴壓力性尿失禁患者子宮韌帶Ⅰ、Ⅲ型膠原表達水平均顯著低于對照組;Vulic等[23]研究發現POP患者子宮骶韌帶中基質金屬蛋白酶1表達增加,Ⅰ型膠原表達降低,并認為子宮骶韌帶中Ⅰ型膠原和基質金屬蛋白酶1的表達可能與POP有關。本研究結果顯示外源性過氧化氫孵育4 h后,較低濃度的過氧化氫刺激對子宮韌帶成纖維細胞膠原合成代謝與對照組無顯著差異,而高濃度的過氧化氫促進Ⅰ型、Ⅲ型膠原的分解代謝。因此,我們認為氧化應激是導致子宮韌帶成纖維細胞膠原代謝紊亂的原因之一。Western blot檢測實驗可知,高氧化應激組白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的蛋白表達水平明顯高于低氧化應激組、對照組;同時低氧化應激組也輕微提高白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的蛋白表達水平,但與對照組比較無顯著差異,說明這些炎性因子參與了過氧化氫誘導的子宮韌帶組織炎癥反應。

目前研究較廣泛的與細胞增殖、凋亡發生過程相關的信號通路分子主要有MEK-ERK1/2與PI3KAkt信號通路等[24-26]。ERK1/2是MAPK通路中極其重要的組成部分之一,研究表明,ERK活化后通過促進Cyclin D1表達以及其與CDK4結合而促進細胞周期進展,促進細胞增殖分化。ERK持續激活可以阻止細胞凋亡的發生,抑制ERK的活化能夠促進細胞凋亡的發生[27]。PI3K是生長因子受體下游直接的信號傳遞分子,負責傳遞細胞內有絲分裂信號,對細胞的生存、增殖起重要作用[28-29]。本實驗證實,對大鼠子宮韌帶成纖維細胞進行低、高濃度過氧化氫干預4 h后,有效抑制MAPK-ERK1/2、PI3K-Akt信號通路的活化,與對照組和低氧化應激組相比,高氧化應激組p-ERK1/2、p-Akt的表達明顯降低(P＜0.05),而總蛋白ERK1/2、Akt的表達基本保持不變,上述指標在對照組和低氧化應激組無顯著差異。這些結果表明高濃度過氧化氫通過磷酸化ERK1/2和Akt,抑制細胞增殖和促進細胞凋亡過程。總之,高濃度過氧化氫通過抑制ERK1/2信號通路,下調Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達,抑制子宮韌帶成纖維細胞的增殖,研究表明參與盆腔功能障礙性疾病發生發展的分子機制十復雜且涉及的信號通路不止一種[30-32],各個通路共同參與了盆腔功能障礙性疾病的發展,為解釋盆腔功能障礙性疾病的相關作用機制提供更多的實驗依據。

綜上所述,氧化應激微環境中較高濃度的過氧化氫通過抑制MAPK通路中ERK1/2表達和PI3KAkt通路中Akt表達,引起子宮韌帶成纖維細胞的增殖能力下降,細胞凋亡增加,膠原合成受阻。另外,氧化應激導致炎癥因子表達增加,對子宮韌帶成纖維細胞的增殖、凋亡有一定影響,并進一步影響膠原合成,但其具體機制尚需進一步研究。