石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊的功效成分測定與其對CI/F1小鼠免疫功能的調節作用研究

程 潔張成香孫 杰李世芬王玉邦環 飛*

(1.江蘇省醫藥農藥獸藥安全性評價與研究中心,南京 211166;2.南京醫科大學公共衛生學院,南京 211166)

鐵皮石斛主要成分有大量多糖、生物堿、氨基酸、微量元素等,其主要藥理作用有提高免疫力,降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、抗疲勞[1]。蝙蝠蛾擬青霉菌從冬蟲夏草中分離純化后所得麥角菌科蝙蝠蛾擬青霉菌株,研究表明其具有提高免疫活性和抗疲勞作用[2-3]。人參提取物中的主要功效成分為人參皂甙、多糖,還含有少量黃酮、多肽、甾醇、氨基酸、蛋白質、生物堿、有機酸以及木質素等多種化學成分。人參具有增強免疫力、改善記憶力、改善心血管功能、抗腫瘤和延緩衰老等藥理作用[4-5]。干姜作為傳統常用藥食同源的中藥材,其性熱味辛,功效為溫中散寒,回陽通脈,溫肺化飲[6],干姜理化作用為解熱、鎮痛、抗炎、抑菌、改善心血管功能、還具有保護胃黏膜、抗潰瘍以及保肝利膽等作用[7]。

干姜和鐵皮石斛作為“藥食同源”的中藥材,本身食用安全,研究表明鐵皮石斛、人參、蝙蝠蛾擬青霉菌及其制劑均未發現毒性、食用安全,可進一步開發利用復配成具保健功能的食品[8-12]。不同植物多糖對免疫調節功效不同[13],同時根據健康需求和藥性配伍不同的中藥材,達到協同作用,提高保健食品的功效,將鐵皮石斛和人參提取物,并輔以蝙蝠蛾擬青霉菌粉、干姜提取物為原料配伍制成石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊。本實驗對石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊的功效成分測定及其對小鼠免疫系統影響的研究,旨在為進一步開發利用鐵皮石斛、人參提取物、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、干姜提取物復方的保健功能提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇8~10周齡(體重為19.0~21.7 g)的SPF級雌性小鼠200只,品系為CI/F1(BALB/c與ICR雜交一代),由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2018-0006]提供。動物飼養于南京醫科大學衛生分析檢測中心屏障系統[SYXK(蘇)2020-0006],并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷,倫理審批經南京醫科大學衛生分析檢測中心實驗動物倫理委員會審核通過(GZ01020160063-3)。

1.2 主要試劑與儀器

石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊由某公司提供,主要成分包括鐵皮石斛133 g、人參提取物45 g、蝙蝠蛾擬青霉菌粉111 g、干姜提取物24 g、微晶纖維素32 g和二氧化硅5 g按比例混后制成膠囊,人體推薦劑量為每人每天3.15 g。

培養基(RPMI1640,Gibco公司,美國);刀豆蛋白A(ConA,Sigma公司,美國);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);吩嗪二甲酯硫酸鹽(NP40,Fluka公司,美國);2,4-二硝基氟苯(DNFB,醫藥集團(上海)化學試劑公司);四甲基偶氮哇(MTT,Amresco公司,美國);印度墨汁(北京篤信精細制劑廠);無菌脫纖維羊血(SRBC,江蘇博達生物工程有限公司);雞紅細胞懸液為實驗室自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 功能成分含量測定

(1)人參皂甙

供試品采用水超聲30 min,定容后搖勻,放置后吸取上清液備用進行柱層析[14]。采用3 cm的Amberlite-XAD-2大孔樹脂和1 cm中性氧化鋁作為層析柱,先后用70%乙醇與水洗柱,棄去洗脫液,加入1 mL已處理好的實驗溶液,先用25 mL水洗柱,棄去洗脫液,再用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂甙,收集洗脫液,60℃揮干;加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶解,再加0.8 mL高氯酸,混勻后60℃水浴10 min,冷卻后加入冰乙酸5 mL搖勻,采用分光光度計于560 nm波長處與標準管一起進行比色測定,以人參皂甙Re為對照品。

(2)多糖測定

供試品采用水加熱回流2 h[15],定容,混勻,濾過;取濾液2 mL,加入無水乙醇定容至10 mL,搖勻,冷藏1 h后離心(4000 r/min,20 min),棄去上清液,沉淀加80%乙醇洗滌2次,離心,棄去上清液,沉淀加熱水溶解,冷卻,定容后待測備用;取1 mL待測溶液后加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻、加硫酸5 mL后搖勻、置沸水浴中加熱20 min,冷卻后采用分光光度計于488 nm波長處與標準管一起進行比色測定,以無水葡萄糖為對照品。

(3)腺苷測定

供試品采用水超聲提取10 min后[14],定容混勻后離心(3000 r/min,3 min),經0.45μm濾膜過濾后采用液相色譜測定,色譜柱為C18柱,以1 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇=90∶10為流動相,流量1.0 mL/min,檢測波長為254 nm。

1.3.2 小鼠調節免疫功能實驗

設定小鼠劑量分別為260 mg/kg、530 mg/kg和1580 mg/kg 3個劑量組[13],根據體表面積將小鼠劑量換算為人體等效劑量分別為21.1 mg/kg、43.1 mg/kg、128.4 mg/kg;陰性對照組(0 mg/kg,無菌水)。200只小鼠根據初始體重隨機分組,先分成5個大組,再按受試物給予劑量分成4個組,總計20組,每組10只小鼠。各免疫功能實驗分組情況見表1。

表1 分組表Table 1 Grouping table

每天同一時間段給予受試物,連續30 d,各組小鼠按10 mL/kg灌胃給予受試物,30 d后測定調節免疫的各項指標。

(1)體重和免疫器官相對重量

連續給予受試物30 d后,取用于小鼠碳廓清實驗(第4大組)的40只小鼠,稱量終未體重,頸椎脫臼法處死小鼠,無菌條件下摘取脾和胸腺,并稱量臟器重量,按公式:相對重量=臟器絕對重量(mg)/小鼠體重(g),計算各自免疫器官相對重量。

(2)小鼠淋巴細胞增殖實驗(ConA誘導的脾淋巴細胞轉化實驗)及NK細胞活性測定

連續給予受試物30 d后,取第1大組的40只小鼠,稱量終末體重,頸椎脫臼法處死小鼠,無菌條件下摘取脾,研磨脾,無菌細胞篩網過濾,用Hank’s液洗2次,每次離心10 min(1000 r/min),制成單個細胞懸液,取部分細胞用RPMI1640培養液將調整濃度,24孔培養板加入1 mL濃度為每毫升3×106個細胞懸液,平行兩孔,一孔加濃度為100μg/mL的ConA溶液75μL,另一孔細胞作為對照,置于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h。培養結束前4 h,吸去上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含胎牛血清的培養液,每孔加入50μL濃度為5 mg/mL的MTT,繼續培養4 h后每孔加入1 mL酸性異丙醇,混勻,使紫色結晶溶解,將溶解液轉移至96孔培養板測定各孔光密度值,酶標儀測定波長為570 nm,按公式:淋巴細胞增殖能力=含有ConA的組光密度值-無ConA的組光密度值。

取小鼠淋巴細胞增殖實驗中制成的單個細胞懸液,離心10 min(1000 r/min)棄上清后加入滅菌水裂解紅細胞20 s,加入Hank’s液混勻后離心,棄上清用含10%胎牛血清完全培養液調整細胞濃度。取濃度為每毫升2×107個的脾細胞懸液100μL和濃度為每毫升4×105個的YAC-1細胞懸液100μL加入96孔培養板(U型),混勻后置于5%CO2、37℃的條件下培養4 h,離心,取上清液100μL轉移至96孔培養板(平底)中,與100μL的LDH基質液反應10 min,加終止液30μL(1 mol/L的HCl)后測定各孔光密度值,酶標儀測定波長為490 nm,按公式:NK細胞活性(%)=(反應孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)×100,計算NK細胞活性。

(3)DNFB誘導小鼠遲發型變態反應(DTH)

連續給予受試物30 d后,取第2大組的40只小鼠腹部去毛,范圍約3 cm×3 cm,用濃度10 mg/mL DNFB溶液50μL均勻涂抹誘導致敏,5 d后于小鼠右耳雙面涂均勻抹10μL激發,激發后24 h頸椎脫臼法處死小鼠,左右耳各剪下直徑為8 mm的圓形耳片,稱重。按公式:耳重差(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg),計算右耳腫脹程度,以反映受試物對DNFB誘導小鼠遲發型變態反應影響程度。

(4)抗體生成細胞檢測和血清溶血素測定

連續給予受試物30 d后,取第3大組的40只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積SRBC懸液,4 d后所有小鼠從眼內眥靜脈叢采集血液并離心血清備用(用于溶血素測定)。頸椎脫臼法處死小鼠,摘取脾,研磨脾,無菌細胞篩網過濾,用Hank’s液洗2次,每次離心10 min(1000 r/min),制成單個細胞懸液備用。將表層培養基加熱溶解后與等量2倍濃度的Hank’s液混勻,按每管0.5 mL分裝,再向管內加50μL的10%壓積SRBC,25μL的脾細胞懸液,混勻后倒在已刷瓊脂糖薄層的玻片上,5%CO2、37℃條件下培養1.5 h,然后加入補體,繼續培養1.5 h后,計數溶血形成的空斑數。用緩沖液1∶200稀釋已離心好的血清,常規方法測定SRBC半數溶血時的光密度值,酶標儀測定波長為540 nm。按公式:半數溶血值HC50=樣品光密度值/SRBC半數溶血時的光密度值×稀釋倍數,計算半數溶血值。

(5)小鼠碳廓清實驗

連續給予受試物30 d后,取第4大組的40只小鼠尾靜脈注入印度墨汁,2 min和10 min后取血,用0.1%Na2CO3溶液稀釋100倍,于600 nm波長處測光密度值,取肝、脾、胸腺并稱重,通過光密度值、肝、脾重量計算吞噬指數a。公式如下:

(6)小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

連續給予受試物30 d后,取第5大組的40只小鼠。處死動物前4 d給每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積SRBC,激活小鼠巨噬細胞。頸椎脫臼法處死小鼠,每只小鼠腹腔注射加4 mL含胎牛血清的Hank’s液,按揉腹部20次洗出腹腔巨噬細胞,吸取腹腔洗液0.5 mL與0.5 mL 1%雞血紅細胞懸液混勻。取0.5 mL混合液,加有玻片的瓊脂圈內。放置孵箱內37℃孵育20 min。孵育結束用生理鹽清洗,常規固定與Giemsa染色,鏡檢。按公式:吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數×100,吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞數,計算數吞噬率和吞噬指數。

1.4 統計學方法

所有實驗結果采用SPSS 22.0軟件計算與分析,小鼠各周體重、免疫器官相對重量、淋巴細胞增殖能力、耳殼增重、溶血空斑數、血清半數溶血值等指標采用SPSS軟件對各實驗組原始數據進行方差齊性檢驗,符合方差齊的要求的數據資料用單因素方差分析方法中多個實驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理;對方差不齊的數據采用秩和檢驗進行統計處理;對并將吞噬百分率和NK細胞活性需經sin-1P1/2(P表示為吞噬百分率或NK細胞活性,將百分率轉化成小數表示)轉化,符合方差齊的要求后進行統計處理。檢驗水準α=0.05,P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 功能成分含量測定

石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊的功效成分人參皂甙、多糖和腺苷的含量測定結果見表2。

表2 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊功效成分測定結果Table 2 Determination results of effective components in Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule

2.2 小鼠調節免疫功能實驗

2.2.1 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠各周及終末體重和免疫器官相對重量的影響

石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊各劑量組的小鼠各周及終末體重與陰性對照組比無顯著差異;免疫器官相對重量與陰性對照組比無顯著性差異(表3)。

表3 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠胸腺和脾相對重量的影響(±s,n=10)Table 3 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmothginger Capsule on relative weight of thymus and spleen in mice

表3 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠胸腺和脾相對重量的影響(±s,n=10)Table 3 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmothginger Capsule on relative weight of thymus and spleen in mice

劑量(mg/kg)Dose胸腺/體重(%)Thymus gland/body weight脾/體重(%)Spleen/body weight 00.192±0.0210.385±0.0252600.197±0.0200.390±0.0385300.208±0.0320.396±0.03915800.191±0.0210.381±0.018

2.2.2 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠脾淋巴細胞增殖能力、右耳腫脹程度的影響

由表4結果可見,1580 mg/(kg·d)組中含有ConA小鼠脾淋巴細胞孔光密度值與無ConA孔的差值高于0 mg/(kg·d)組,比較有顯著差異(P＜0.05),顯示石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對ConA誘導的脾淋巴細胞轉化有增加作用,提高脾淋巴細胞增殖能力;1580 mg/(kg·d)組耳重差增重高于0 mg/(kg·d)組,比較有顯著差異(P＜0.05),顯示石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對DNFB誘導小鼠耳腫脹程度明顯增強,反映小鼠遲發型變態反應增強。脾淋巴細胞增殖能力增加和遲發型變態反應增強均反映石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠細胞免疫功能、特異性免疫功能有增強作用。

表4 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對脾淋巴細胞增殖能力、右耳腫脹程度的影響(±s,n=10)Table 4 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on spleen lymphocyte proliferation and right ear swelling

表4 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對脾淋巴細胞增殖能力、右耳腫脹程度的影響(±s,n=10)Table 4 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on spleen lymphocyte proliferation and right ear swelling

注:與對照組比較,*P＜0.05。下同。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.The same as below.

劑量(mg/kg)Dose加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值Difference of absorbance between hole with and without ConA耳重差(mg)Ear weight difference 00.095±0.03910.9±1.72600.109±0.03111.6±3.25300.117±0.04113.0±2.215800.148±0.066* 13.7±1.3*

2.2.3 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠抗體生成細胞水平和半數溶血值的影響

由表5結果可見,1580 mg/(kg·d)組小鼠溶血形成的空斑數高于0 mg/(kg·d)組,比較有顯著差異(P＜0.05),顯示石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對促進小鼠抗體生成細胞水平升高。260 mg/(kg·d)、530 mg/(kg·d)、1580 mg/(kg·d)組小鼠HC50與0 mg/(kg·d)組比較無顯著性差異(P＜0.05)。雖然石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對HC50升高影響沒有顯著性差異,結合溶血空斑數的升高,表明石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊可在一定程度上增強小鼠的體液免疫功能。

表5 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠抗體生成細胞水平和半數溶血值的影響(±s,n=10)Table 5 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on antibody producing cells and half hemolytic value of mice

表5 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠抗體生成細胞水平和半數溶血值的影響(±s,n=10)Table 5 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on antibody producing cells and half hemolytic value of mice

劑量(mg/kg)Dose溶血空斑數(103個/全脾細胞)Number of hemolytic plaque(103/whole spleen cells)HC50 011.8±1.678±1926012.9±1.578±2753013.7±2.777±15158014.8±2.2* 91±20

2.2.4 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠單核/巨噬細胞吞噬能力的影響

由表6結果可見,1580 mg/(kg·d)組的吞噬指數a高于0 mg/(kg·d)組,比較有顯著差異(P＜0.05);1580 mg/(kg·d)組的吞噬百分率及吞噬指數均高于0 mg/(kg·d)組,比較有顯著差異(P＜0.05);吞噬指數a升高表明石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠單核細胞吞噬能力(即碳廓清的能力)有增強作用,吞噬百分率及吞噬指數的升高表明石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對增強小鼠巨噬細胞吞噬能力有增強作用,單核/巨噬細胞吞噬能力增強反映石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊具有增強小鼠非特異性免疫功能。

表6 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠單核-巨噬功能的影響(±s,n=10)Table 6 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on mononuclear andmegaphagocytic function in mice

表6 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠單核-巨噬功能的影響(±s,n=10)Table 6 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on mononuclear andmegaphagocytic function in mice

劑量(mg/kg)Group吞噬指數a Phagocytic index a吞噬百分率(%)Phagocytosis percentage吞噬指數Phagocytic index 05.68±0.7422.5±3.50.28±0.042605.58±0.8424.7±4.10.30±0.045305.61±1.0324.7±4.10.31±0.0515806.70±0.92* 26.5±2.4* 0.33±0.05*

2.2.5 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠NK細胞活性的影響

由表7結果可見,260 mg/(kg·d)、530 mg/(kg·d)、1580 mg/(kg·d)組小鼠NK細胞活性與0 mg/(kg·d)組比較無顯著性差異(P＞0.05)。表明石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對NK細胞活性沒有調節作用。

表7 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠NK細胞活性的影響(±s,n=10)Table 7 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on NK cell activity in mice

表7 石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠NK細胞活性的影響(±s,n=10)Table 7 Effects of Dendrobium-ginseng-paecilomyces batmoth-ginger Capsule on NK cell activity in mice

劑量(mg/kg)Group NK細胞活性(%)NK cell activity 032.9±7.626031.0±5.953037.6±8.4158027.5±5.0

3 討論

雄性小鼠好動,群養時的好斗習性容易影響實驗結果,本研究僅選用雌性小鼠,符合保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)單一性別的要求,同時也滿足了3R原則。本實驗觀察石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊對小鼠細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能三個方面均有明顯作用。細胞免疫方面:石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊1580 mg/kg組可增強脾淋巴細胞增殖能力和增強DNFB誘導小鼠遲發型變態反應,均提示其具有明顯的細胞免疫的功能;單核-巨噬細胞功能方面:石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊1580 mg/kg組小鼠碳廓清吞噬指數a、小鼠腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率及吞噬指數均有顯著性增加,提示其具有增強單核巨噬細胞的吞噬能力;而且細胞免疫、單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要標準,石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊具有明顯的增加機體非特異性免疫功能;體液免疫方面:石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊1580 mg/kg組的小鼠組抗體生成細胞水平有明顯提高,該膠囊可在一定程度上調節小鼠體液免疫功能,屬于特異性免疫功能增強。

石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊是鐵皮石斛、人參提取物、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、干姜提取物為主要原料所制成,調節免疫功能作用的功效成分主要為人參皂甙、多糖和腺苷,以上實驗結果與文獻報道一致,陳星星等[16]研究表明鐵皮石斛能有效協同脂多糖(LPS)和刀豆蛋白(ConA)水平促進免疫制型小鼠脾T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖;Liu等[17]對BALB/c小鼠口服不同劑量的鐵皮石斛及其多糖對巨噬細胞的吞噬能力有顯著增強;滕偉卓[3]研究表明蝙蝠蛾擬青霉菌粉可增強小鼠機體非特異性免疫功能和使遲發型超敏反應加劇,使淋巴細胞轉化率增加;人參皂苷Rg1及其代謝產物可在體內直接激活T細胞增殖、抑制活化狀態的T細胞,并提高巨噬細胞吞噬及釋放NO的能力[18];王華慶等[19]研究發現人參皂苷Rg3不僅能明顯促進淋巴細胞的增殖,還可以提高自然殺傷細胞活性和T細胞亞群的活性水平[16];人參多糖能夠促進T、B淋巴細胞增殖,激活脾細胞[20];有研究表明人參多糖除了能促進淋巴細胞增殖速度還能增強巨噬細胞的吞噬能力[21];鐵皮石斛、人參等復合配方產品的研究表明,其可提高機體的特異性和非特異性免疫功能[22-23]。

綜上所述,石斛人參蝙蝠蛾姜膠囊具有免疫調節功能,主要功效與人參和鐵皮石斛中的各種植物多糖、人參中皂甙、蝙蝠蛾擬青霉菌粉中腺苷有關。本次實驗結果可為以后人參、鐵皮石斛等中藥材的開發和配方優化提供部分數據。