高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同檢雞肉氟喹諾酮類與金剛烷胺殘留分析

周燦 隆雪明 楊彥寧 陳福華 歐海軍 張港 魏唯

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所 410006）

近年來(lái)，禽肉產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)成為是畜禽產(chǎn)品中安全監(jiān)控的重點(diǎn)，特別是氟喹諾酮類藥物及抗病毒藥物的監(jiān)測(cè)成為重中之重，國(guó)家制定了嚴(yán)格的法律法規(guī)，加強(qiáng)了食品安全監(jiān)測(cè)工作。

目前，關(guān)于這些抗菌抗病毒藥物的檢測(cè)方法較多，有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等。但這些方法大多針對(duì)單一類藥物檢測(cè)，存在檢測(cè)耗時(shí)耗力、效率不高等弊端。本試驗(yàn)旨在建立高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)雞肉中金剛烷胺與8 種氟喹諾酮類藥物殘留量，該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，便于推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC-30A/QTRAP 4500 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（SCIEX，日本島津公司），高效冷凍離心機(jī)（Tmermo MμLTIFμGE X1R），純水儀（Millipore 公司）。

諾氟沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、鹽酸洛美沙星、甲磺酸達(dá)氟沙星均為德國(guó)Dr 公司，鹽酸沙拉沙星、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，金剛烷胺為曼哈格，恩諾沙星D5、環(huán)丙沙星D8、金剛烷胺D15、沙拉-D8、環(huán)丙-D8、諾氟-D5 為阿爾塔。甲醇、乙腈、乙酸、甲酸均為色譜純、正己烷為分析純、實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇溶解定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為500mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于棕色瓶中，于-20℃冰箱中保存。再根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。

1.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)后的試樣2.00g 于50ml 離心管中，加入100ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)溶液0.05ml，加入10ml 1%乙酸乙腈溶液，蓋上塞子，于渦旋混合儀上渦旋2min，以14000r/min 的速度離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，氮吹至近干，用1.00ml 0.1%甲酸水乙腈（9+1）溶解，加入2ml 的乙腈飽和后的正己烷，渦旋1min，高速離心5min 后取下層清液過(guò)0.22μm 濾膜，待測(cè)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱型號(hào)為BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm），流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈溶液，梯度洗脫條件見表1。流速為0.3ml/min，柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子噴霧離子源（ESI），掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5500V；離子源溫度(TEM)：550℃；氣簾氣 (CμR) ∶10psi；霧化氣（GS1）：50psi；輔助加熱氣 (GS2)：50psi；碰撞氣 (CAD)：Mediμm；其余質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

喹諾酮類藥物極性較大，且該化合物結(jié)構(gòu)式中含有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性，金剛烷胺是堿性化合物，本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)考察了1%乙酸乙腈，乙酸乙酯，1%甲酸甲醇，1%甲酸乙酸乙酯作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯、酸化乙酸乙酯只對(duì)恩諾沙星有一定的提取效果，其他幾種藥物提取效率均很低。甲醇的極性較強(qiáng)，提取的雜質(zhì)較多，且氮?dú)怆y吹干，不利于實(shí)驗(yàn)的開展。采用1%乙酸乙腈提取時(shí)，乙腈對(duì)生物蛋白沉淀作用較好，能起到一定的凈化作用，對(duì)雞肉的8 種氟喹諾酮類及金剛烷胺有較好的回收率。為了簡(jiǎn)化過(guò)程本方法采用1%乙酸乙腈提取一次，結(jié)果表明，用內(nèi)標(biāo)校正能獲得較好的回收率。

2.2 凈化條件優(yōu)化

食品獸藥殘留分析常用凈化方法有冷凍去脂法，有機(jī)溶劑液液去脂法，固相萃取柱法等。比較了固相萃取與正己烷液液萃取，結(jié)果表明，固相萃取對(duì)回收率有一定影響。本方法采用正己烷去脂，同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法校正，回收率更高，定性更準(zhǔn)確。

2.3 線性方程、檢出限、定量限

9 種藥物在0.5～20μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，以空白樣品添加濃度信噪比S/N≥3 確定方法檢出限（LOD），以S/N≥10 倍信噪比的添加濃度確定定量限（LOQ），LOD 為0.05～0.5μg/kg，LOQ 為0.1～1μg/kg。

2.4 回收率和精密度

在1、2、5μg/kg 添加濃度下對(duì)雞肉進(jìn)行氟喹諾酮類及金剛烷胺類的加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)（n=6），其中試樣添加回收率在70%～115%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～12.2%。

3 結(jié)論

本文建立了LC-MS/MS 快速測(cè)定雞肉中8 種氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺的方法。前處理過(guò)程簡(jiǎn)單高效，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法有效的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響。該方法檢出限、定量限完全滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，精密度好，準(zhǔn)確度高，適用于雞肉中氟喹諾酮類及金剛烷胺的檢測(cè)分析。