轉錄激活因子4過表達在內質網過度應激所致骨質疏松中的意義

李少華，張鐵山，邢克炎，何新莊，李玉偉

1.永煤集團總醫院骨科，商丘 476600

2.漯河市中心醫院骨科，漯河 462000

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨微結構退化和骨脆性增加為特點的骨代謝疾病［1-2］。正常的骨代謝是一種由成骨細胞產生新骨組織和破骨細胞吸收舊骨組織構成的動態平衡［3］。成骨細胞的分化涉及多種轉錄因子，如Runt相關轉錄因子2（Runx2）、成骨相關轉錄因子（Osx）、骨鈣素（Ocn）和轉錄激活因子4（ATF4）等。有研究［4］顯示，ATF4基因敲除小鼠失去形成成熟骨架的能力。在成骨細胞中，ATF4通過與ATF3結合，促進下游C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表達，從而影響骨形成［5］。CHOP是骨骼發育的必需因子，有研究［6］發現其可與骨形態發生蛋白（BMP）相互作用，但CHOP的過表達會使骨組織受損。

內質網應激（ERS）是細胞內的一種重要防御機制［7］，主要通過未折疊蛋白反應（UPR）發揮作用，而UPR主要的經典通路包括雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶（PERK）/ATF6/肌醇需求酶1（IRE1）［8］。在骨代謝過程中，內質網對細胞內穩態的維持至關重要［9-10］。既往研究［11-13］證明，ERS與骨質疏松癥密切相關，但ERS過度導致骨質疏松的分子機制仍不清楚。本研究通過ERS通路激動劑衣霉素（TM）模型和ATF4過表達模型，研究ATF4在ERS導致骨質疏松中的調控作用，為臨床防止ERS過度導致骨質疏松提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

雌雄2對ATF4過表達雜合子C57BL/6J小鼠由美國Jackson實驗室提供（貨號：013072）。小鼠進行擴增繁殖后，通過鼠尾裂解法在新生小鼠中篩選出ATF過表達純合子小鼠和野生型小鼠，待小鼠生長至12周齡即可進行下一步實驗。戊巴比妥（生工生物工程股份有限公司，上海）；TM（Selleck生物科技有限公司，美國）；4%多聚甲醛溶液（碧云天生物技術有限公司，上海）；TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）、反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；PCR試劑盒（寶生物工程有限公司，大連）；RIPA裂解液和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（碧云天生物技術有限公司，上海）；BCA試劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Runx2、Osx、Ocn、ATF4、CHOP和GAPDH抗體（Santa Cruz公司，美國）；二抗（賽信通生物試劑有限公司，上海 ）；SDS-PAGE試劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；超敏型ECL發光液（四正柏生物科技有限公司，北京）。

1.2 動物分組與模型建立

實驗小鼠分為4組，每組10只。對照野生組：野生型小鼠鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 μL。TM野生組：野生型小鼠鼠尾靜脈注射0.2 μL ERS通路激動劑TM（1 mg/kg）。ATF4過表達純合子組（ATF4+/+組）：ATF4過表達純合子小鼠鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 μL。TM干預ATF4過表達純合子組（TM ATF4+/+組）：ATF4過表達純合子小鼠鼠尾靜脈注射0.2 μL TM（1 mg/kg）。干預周期為6周。

1.3 影像學分析

干預6周后，采用2%戊巴比妥鈉將各組小鼠麻醉后，迅速剝離小鼠左股骨，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，換取新4%多聚甲醛溶液。將固定的股骨擦干，使用小動物顯微影像系統（microCT，Hiscan XM）進行檢測。掃描條件：60 kV，133 μA，單次曝光時間1.2 s，掃描分辨率9 μm，掃描角度間隔0.5°，掃描360°。待掃描成功后，拷貝文件，采用重建軟件Hiscan Reconstruct software和分析軟件Hiscan Analyzer software進行分析。分析小鼠股骨骨密度（BMD）、骨小梁骨體積分數（Tb.BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）和骨小梁間隔（Tb.Sp）。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）染色

所有小鼠的左股骨microCT掃描完成后，放入4%多聚甲醛中繼續固定24 h。用14% EDTA溶液脫鈣14 d，常規脫蠟、包埋、石蠟切片，切片厚度為3～4 μm。用蘇木精溶液染色1 min，流水沖洗5 min；0.5%伊紅染色3 min，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Image J軟件計算骨小梁相對面積。

1.5 成骨相關蛋白和CHOP的表達檢測

將小鼠的右股骨迅速剝離后，放入EP管中，于-20℃保存。分別取各組5只小鼠的右股骨用液氮碾磨至粉末后，使用RIPA緩沖液提取骨組織中總蛋白。利用BCA試劑檢測蛋白質總濃度后將其變性，保存于-20℃冰箱，以備蛋白質印跡檢測。取出骨組織總蛋白，采用SDS-PAGE分離蛋白條帶，再轉移至PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 ～ 2 h后，再用TBST洗滌3次，每次10 min。然后將膜放入以1∶1 000稀釋的一抗（Runx2、Osx、Ocn、ATF4、CHOP和GAPDH抗體）中，4℃ 孵育10 h以上。再用TBST洗滌3次后，加入以1∶4 000稀釋的相應二抗中，室溫孵育2 h。TBST 洗滌3次，每次10 min。將超敏ECL發光液滴在膜上，立即放入化學發光成像儀（Invitorgen公司，美國）進行化學發光。通過Image J軟件分析結果，以GAPDH標準化目的蛋白為相對表達量。

1.6 成骨相關基因和CHOP的表達檢測

取各組剩余的5只小鼠右股骨用液氮碾磨至粉末后，使用TRIzol試劑提取細胞的總RNA。用分光光度計檢測RNA的純度和濃度后，將其逆轉錄合成cDNA。隨后在ABI 7500實時PCR系統（ABI公司，美國）上進行實時熒光定量PCR檢測。引物序列：Runx2正 鏈 引 物5'-GTACTAGCTTAACGTA-3'，反鏈引物5'-GATCAGGTAACAATCA-3'；Osx正鏈引物5'-AGTCACCGTACCCATG-3'，反鏈引物5'-GTAACGTACGTAAAGTCC-3'；Ocn正鏈引物5'-GCTAGGTCAAGTCAATCAA-3'，反 鏈 引 物5'- GTAACGTAACCCGTAT-3'；ATF4正鏈引物5'-CTAGACTAGTTCAGATTCCA-3'，反 鏈 引 物5'-AGTCTTATTAGTCAGGTCA-3'；CHOP正 鏈引物5’-TGATCGTGGTAACTAATT-3'，反鏈引物5'-TGATGCATTAGCTAGAAT-3'；GAPDH正鏈引物5'-AGTCGTTACGTACCGT-3'，反鏈引物5'-TAGTCA GTAAGGTCATATT-3'。PCR擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s、60℃ 50 s、72℃ 35 s，38個循環。GAPDH作為mRNA的標準內參，基因表達結果均以2-△△ct進行統計。

1.7 統計學處理

采用GraphPad Prism 7軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ATF4在各組小鼠的表達

蛋白質印跡檢測和實時熒光定量PCR結果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠股骨中ATF4蛋白和基因表達量增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖1）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的ATF4蛋白和基因表達量增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖1）。

圖1 4組小鼠股骨中ATF4蛋白和基因表達Fig. 1 Expression of ATF4 protein and gene in femur of 4 group mice

2.2 小鼠股骨影像學結果

MicroCT結果顯示，與對照野生組相比，其他3組小鼠股骨BMD、Tb.BV/TV和Tb.N降低，Tb.Sp升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，表1，圖2）。與TM野生組和ATF4+/+組相比，TM ATF4+/+組小鼠的BMD、Tb.BV/TV和Tb.N降低，Tb.Sp升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，表1，圖2）。

圖2 4組小鼠股骨microCT掃描三維重建Fig. 2 MicroCT three-dimensional reconstruction of femur in 4 group mice

表1 4組小鼠骨密度相關指標Tab. 1 Related indexes of bone mineral density of 4 group mice n=10，±s

表1 4組小鼠骨密度相關指標Tab. 1 Related indexes of bone mineral density of 4 group mice n=10，±s

注：*與對照野生組比較，P ＜ 0.05；△與TM野生組和ATF4+/+組比較，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with control wild group；△P ＜ 0.05，compared with TM wild group and ATF4+/+ group.

組別Group BMD/（g·cm-3） Tb.BV/TV Tb.N/mm-1 Tb.Sp/μm對照野生Control wild862.90±7.86 7.30±1.01 2.133±0.402 0.19±0.03 TM野生TM wild 445.50±12.15* 3.15±0.89* 1.113±0.310* 0.41±0.05*ATF4+/+ 392.70±6.09* 3.22±0.45* 1.213±0.310* 0.37±0.04*TM ATF4+/+ 301.60±10.22*△1.16±0.52*△0.623±0.102*△0.52±0.04*△

2.3 HE染色結果

HE染色結果顯示，對照野生組小鼠股骨干骺端鏡下骨小梁呈網狀，排列整齊，骨微結構完整。與對照野生組小鼠相比，其他3組小鼠股骨干骺端骨小梁變細，結構斷裂混亂，骨小梁數量減少；并且骨小梁相對面積減少，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3）。與TM野生組和ATF4+/+組小鼠相比，TM ATF4+/+組的股骨干骺端骨小梁更加細小，骨小梁數量明顯減少，骨髓腔間隙變大；并且骨小梁相對面積減少，差異有統計學意義（P＜ 0.05，圖3）。

圖3 4組小鼠股骨HE染色結果Fig. 3 HE staining results of femur in 4 group mice

2.4 成骨相關因子表達

蛋白質印跡分析和實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠的成骨相關因子Runx2、OSX、Ocn的蛋白和基因表達量降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖4）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的Runx2、Osx、Ocn蛋白和基因表達量降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 4組小鼠股骨中成骨相關因子蛋白和基因表達Fig. 4 Protein and gene expressions of bone formation related factors of femur in 4 group mice

2.5 CHOP表達

蛋白質印跡分析和實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照野生組比較，其他3組小鼠CHOP的蛋白和基因表達量增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖5）。與TM野生組和ATF4+/+組比較，TM ATF4+/+組的CHOP的蛋白和基因表達量增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 4組小鼠股骨中CHOP蛋白和基因表達Fig. 5 Protein and gene expressions of CHOP of femur in 4 group mice

3 討 論

ERS是一種細胞自我保護反應，適度的應激可減輕損傷，維護細胞內的穩態，但過度或長期的應激會導致細胞的凋亡［14］。在骨代謝過程中，內質網對細胞內穩態的維持至關重要，一方面，輕度的ERS通過促進Runx2等成骨因子表達維持骨內成骨細胞和破骨細胞生長及骨髓間充質干細胞的分化，并抑制細胞凋亡發生［9］；另一方面，在高強度長時間的應激狀態下，骨內多種信號通路誘導細胞凋亡，加速骨鈣丟失［10］。ERS相關基因參與骨骼細胞的生長和分化，是導致骨質疏松的重要因素之一［15］。

ATF4是ERS影響成骨細胞增殖分化和骨代謝過程的重要因素［6］。ERS通過磷酸化eIF2α促進 ATF4的轉錄，從而激活CHOP信號通路［16］。在ERS過度狀態下，ATF4/CHOP途徑被激活，可促進Bax、Caspase等凋亡信號分子大量生成，進而誘導成骨細胞凋亡，抑制成骨分化，導致骨質疏松、骨發育不全等一系列病理過程［17］。

基于以上研究基礎，本研究通過構建體內模型探討ATF4過表達在ERS所導致骨質疏松中的作用，以及ATF4/CHOP信號通路的變化。研究結果發現，ATF4在骨質疏松小鼠骨組織中表達上調；激活小鼠骨組織的ERS后，ATF4表達增加，而骨相關因子和骨密度均降低；進一步使ATF4過表達后，發現其能抑制小鼠骨代謝，導致小鼠骨質疏松。實驗證明，ATF4可通過ATF4/CHOP信號通路參與ERS進而導致小鼠骨質疏松。

綜上所述，ERS可能通過促進ATF4過表達激活CHOP 信號通路，從而導致骨質疏松的發生。因此，ATF4/CHOP信號通路的激活可能對骨質疏松的發生有重要意義。本研究為動物實驗，更具體的分子機制仍需通過體外實驗進一步驗證。