嘔吐毒素熒光定量快速檢測試紙卡及儀器技術性能優化的研究報告*

鞏性濤 ，王 培 ，肖理文 ，宋永泉 ，徐 秀 ，趙 皖 ，王春霞

（1.山東省糧油檢測中心，濟南 250101；2.南京微測生物科技有限公司，南京 210000；3.山東省中儲糧糧油質監中心有限公司，濟南 250199）

嘔吐毒素主體成分為DON（deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產生。另外，頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強有力免疫抑制劑，其引起的典型癥狀是動物采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素（DON）是其中最重要的一種毒素，主要來自鐮刀菌屬（Fusarium），尤其是禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）和黃色鐮刀菌（Fusariumculmorum）。由于它可引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素（Vomitoxin，VT）[1-2]。

嘔吐毒素是食品中常見的真菌毒素，在自然界中廣泛存在，在歐洲及北美常見的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。在中國2018年白奧明原料與飼料霉菌毒素檢測報告顯示：玉米中嘔吐毒素是15-乙酰嘔吐毒素（被定義為霉菌毒素）出現最多，小麥中3-乙?；鶉I吐毒素、15-乙?；鶉I吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇出現頻率都很高。不管哪種類型嘔吐毒素都具有很高的細胞毒素及免疫抑制性質，會對人類及動物的健康構成威脅，特別是會對免疫功能造成明顯的影響。

根據DON的劑量和暴露時間的不同可引起免疫抑制或免疫刺激，當人攝入了被DON污染的食物后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩及反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統而造成死亡。嘔吐毒素DON對于糧谷類的污染狀況與產毒菌株、溫度、濕度、通風、日照等因素有關，小麥赤霉病主要分布在潮濕的溫帶地區，中國小麥大部分產區恰恰處于這一地帶，這是中國嘔吐毒素污染較嚴重的原因之一，多雨年份尤其在收糧前多雨會導致DON污染狀況更嚴重，如2018年河南、江蘇、安徽、山東部分地區發生大面積嘔吐毒素污染。1998年在國際癌癥研究機構公布的評價報告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物；各國也制定了嚴格限量標準，歐盟要求糧食谷物及其制品中嘔吐毒素最高限量要小于1.0 mg/kg；GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中要求糧食谷物及其制品中嘔吐毒素的含量低于1.0 mg/kg，GB 13078.3-2017《飼料衛生標準》中規定了配合飼料中嘔吐毒素的限量低于 1.0～5.0 mg/kg 不等[3-5]。

目前，國標法測定嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌铮┎捎肏PLC法，此方法需要大型的儀器設備，設備價格昂貴，操作過程復雜、時間較長，且無法在現場和基層小型實驗室使用。也有采用嘔吐毒素酶聯免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙卡等方法，此方法用于大量樣品的篩查，具有操作簡便，檢測快速，成本較低等優點，但準確性和重復性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，針對快速檢測試紙卡存在的不足，山東省糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司對基于熒光定量免疫層析平臺的嘔吐毒素熒光定量快速檢測試紙卡進行了產品的優化升級，使之操作簡單快速、準確性和重復性較高，且使用成本較進口同類產品成本降低30%左右，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品安全[6-7]。

1 試劑、材料、儀器和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，試劑均為分析純，試驗用水均為國標一級蒸餾水。

嘔吐毒素熒光定量快速檢測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標記嘔吐毒素DON抗體；NC膜上噴涂有嘔吐霉毒素DON抗原檢測線和噴涂有羊抗兔二抗控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

嘔吐毒素的標準品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥及面粉等樣品從超市購得或從企業取樣；麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠、面粉加工廠和小麥收儲企業取樣。

1.2 儀器與設備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器，由上海飛測生物科技有限公司提供生產；低速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；漩渦混勻器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細小樣品。稱取過篩后的樣品5.0±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩3 min(或者搖床振蕩3 min）后，4 000 r/min離心2 min，取上清液。

1.3.2 檢測過程

100 μL離心上清液加入1 000 μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3～5 s，然后取 100 μL待測液加入到嘔吐毒素熒光定量試紙卡的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中孵育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光定量免疫分析儀中讀數，讀數值即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于5 000 μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再按照后續步驟進行檢測，所得讀數值乘以5即為樣本最終的檢測濃度。

1.3.3 試紙卡原理

將待測樣品滴加在試紙卡加樣區時，樣品中的嘔吐毒素與結合墊中熒光微球標記的嘔吐毒素抗體結合并通過毛細作用向前層析，到達檢測區后，檢測線T線上固定的嘔吐毒素抗原與剩余未結合的熒光微球標記嘔吐毒素抗體結合。檢測線T線上結合的熒光微球標記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質控線C線結合的熒光標記物與樣品中待測物的量無關，剩余或其它熒光標記物繼續層析達到吸收區。反應結束后，使用熒光定量免疫分析儀讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過儀器內置的標準曲線即可計算出樣品中嘔吐毒素的含量。

1.3.4 試紙卡優化

在單T線的基礎上，增加一條矯正T線，形成質控線C線一條、檢測線T線兩條的方式。

2 檢測結果分析

2.1 嘔吐毒素試紙卡檢測線數量由兩線優化成三線的實驗

選用國標法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素的濃度為 100、250、500、1000、2 500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法同時進行兩線及三線試紙卡檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣，對比試紙卡的靈敏度，檢測結果見表1；選取高中低3個加標濃度點，每個加標樣本檢測6個平行樣，對比試紙卡的重復性 ，檢測結果見表2。

從表1可知，嘔吐毒素三線試紙卡的100 μg/kg檢測靈敏度為34.79%；兩線試紙卡的100 μg/kg檢測靈敏度為23.32%；從單一100 μg/kg濃度點檢測靈敏度對比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對比不同濃度點的檢測靈敏度，也得出嘔吐毒素三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。

表1 嘔吐毒素兩線與三線試紙卡的靈敏度 濃度單位：μg/kg

從表2可知，篩選高中低三個濃度點進行重復性檢測，嘔吐毒素三線試紙卡檢測變異系數CV范圍為4.36%～9.60%；兩線試紙卡檢測變異系數CV范圍為5.55%～12.69%；對比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數CV更小，重復性更高。

表2 嘔吐毒素兩線與三線試紙卡的重復性 濃度單位：μg/kg

綜合嘔吐毒素三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復性對比，嘔吐毒素三線試紙卡比兩線試紙卡靈敏度、重復性更高。

2.2 檢測線數量為三線的嘔吐毒素試紙卡性能檢測

2.2.1 嘔吐毒素試紙卡的檢出限及定量限實驗結果

選用國標法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本20份，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法進行檢測，每個樣本檢測1個試紙卡。檢測結果見表3。

由表3中檢測數據分析可知：嘔吐毒素試紙卡的檢出限為 27.543 μg/kg；定量限為 65.676 μg/kg。

表3 嘔吐毒素試紙卡的檢出限及定量限 濃度單位：μg/kg

2.2.2 嘔吐毒素試紙卡的檢測范圍的實驗結果

選用國標法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素的濃度為 100、250、500、1000、2500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素試紙卡檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣。檢測結果見表4。

通過表4的檢測數據可知，在空白樣本中添加嘔吐毒素的濃度為100 μg/kg時，檢測靈敏度為33.84%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標濃度從100～5 000 μg/kg時，檢測靈敏度范圍為33.84%～94.61，且不同濃度點檢測抑制率分散率較好，因此嘔吐毒素可定量檢測的范圍為100～5 000 μg/kg。

表4 嘔吐毒素試紙卡的檢測范圍 濃度單位：μg/kg

2.2.3 嘔吐毒素試紙卡的準確度和重復性實驗結果

選用國標法測定嘔吐毒素濃度值為空白的樣本中分別添加嘔吐毒素濃度為 100、250、500、1 000、2500、5 000 μg/kg，然后按照嘔吐毒素熒光定量試紙卡的檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測3個平行樣。檢測結果見表5。

通過表5可知，大米樣本的加標回收率為88.83%～117.70%；玉米樣本的加標回收率為86.50%～120.68%；小麥樣本的加標回收率為87.08%～111.28%；綜合三種不同基質樣本加標檢測回收率范圍為86.50%～120.68%，說明樣本加標檢測回收率高，嘔吐毒素試紙卡檢測準確度較高；

表5 嘔吐毒素試紙卡的準確度和重復性 濃度單位：μg/kg

大米樣本的變異系數CV范圍為4.00%～10.10%；玉米樣本的重變異系數CV范圍為1.59%～12.64%，小麥樣本的變異系數CV范圍為5.51%～11.99%；綜合三種不同基質樣本加標檢測變異系數CV范圍為1.59%～12.648%，說明嘔吐毒素試紙卡整體變異系數CV較小，試紙卡重復性較好。

2.2.4 嘔吐毒素試紙卡的穩定性的實驗結果

將嘔吐毒素檢測樣本放在2～10℃環境下保存，并在每個月固定日期進行樣本檢測，篩選固定不同基質已知不同濃度值樣本（德國拜發質控物）用于試紙卡穩定性檢測，每個樣本檢測1個試紙卡，檢測結果見表6。

通過表6數據可知，嘔吐毒素試紙卡在2～10℃保存8個月，不同基質樣本檢測偏差范圍為-7.66%～10.97%，說明嘔吐毒素試紙卡在2～10℃溫度8個月的保存整體偏差在±11%以內，說明產品的穩定性較好。

表6 嘔吐毒素試紙卡的穩定性 濃度單位：μg/kg

2.3 設備與產品優化后進行玉米粉中嘔吐毒素不同單位驗證檢測

驗證單位1：山東省糧油檢測中心；驗證單位2：中儲糧山東分公司質檢中心實驗室；驗證單位3：江蘇省糧油質量監測中心。

通過表7～表15的計算分析可知，三家驗證單位檢測結果平均值也符合國家標準適用性要求，說明設備與產品穩定性較好。

表7 檢出限與定量限 （單位：μg/kg）：玉米基質

表8 濃度水平1準確性結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表9 濃度水平2準確性結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表10 濃度水平3準確性結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表11 濃度水平1臺間差結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表12 濃度水平2臺間差結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表13 濃度水平3臺間差結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表14 濃度水平2重復性結果 （單位：μg/kg）：玉米基質

表15 儀器性穩定結果 單位：μg/kg

2.4 優化試紙卡與其它產品檢測對比

通過表16中優化產品同國外知名品牌產品對同一樣本檢測數據對比，優化產品回收率為99.50%，國外知名品牌產品回收率為82.27%；優化產品變異系數CV為3.21%，國外知名品牌產品回收率為13.07%，從樣本值檢測回收率與變異系數CV數據分析，優化產品檢測效果優于進口產品，說明可以替代進口產品。

表16 優化產品與進口產品脫氧雪腐鐮刀菌稀醇質控品檢測結果 單位：μg/kg

3 結論

從嘔吐毒素熒光定量試紙卡三線與兩線的靈敏度、不同濃度點梯度與重復性等的檢測數據對比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數CV范圍更小，重復性更高。通過對三線試紙卡檢測限、檢測范圍、不同基質樣本重復、穩定性等檢測驗證實驗可知，優化后三線試紙卡的準確度、重復性、穩定性等均達到更優的效果，更能滿足快速定量檢測需求。另外熒光定量免疫分析儀根據儀器穩定性要求檢測鑒定結果可知，儀器穩定性好且兩臺設備的測定結果之間不存在顯著性差異，完全可以替代同類型進口儀器。

從產品性能上綜合評價，普通免疫層析快檢產品通常采用單檢測線（T線）定量方法，雖然產品研發周期短，生產工藝簡單，成本也低，但檢測結果的精密度難以控制，導致結果的重復性較差。嘔吐毒素熒光定量快速檢測試紙卡在單T線的基礎上，增加一條矯正T線，與質控線（C線）一起，形成“雙保險”，大大提升了檢測結果準確度、精密度和重復性。