脂多糖誘導大鼠子宮內膜損傷模型的建立與評價

夏 燕，劉 露，林丹換，張夢莉，練 冰，覃春容

（南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院生殖醫學科，廣東 深圳 518000）

近年來，隨著人工流產術、清宮術等宮腔操作的增加，導致子宮內膜炎及子宮內膜過薄等情況逐年增多。子宮內膜過薄可導致不孕及胚胎反復種植失敗（recurrent implantation failure，RIF）。由于子宮內膜損傷及損傷后修復過程的人體組織標本不易獲得，因此對子宮內膜損傷方面的研究多局限于對超聲檢查獲取的影像學資料進行研究。子宮內膜損傷動物模型的建立，成為研究子宮內膜損傷與修復的可行工具與方法，可為探索子宮內膜損傷的可能病因、子宮內膜的修復機制及促進子宮內膜的修復再生、改善妊娠結局等找到一個更為合理的研究載體。本研究利用不同濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對大鼠進行宮腔灌注，嘗試構建更符合子宮內膜損傷條件的大鼠子內膜損傷動物模型并驗證造模是否成功，為下一步子宮內膜損傷修復機制的研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

性成熟、未交配的特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性SD大鼠（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司實驗動物中心提供）24只，其周齡為6～8周齡，體重為220～260 g。實驗嚴格按照動物倫理學標準開展。對這些大鼠進行常規適應性喂養1周后，每周在固定時間對其進行陰道涂片檢查，觀察其動情周期。

1.2 試劑及儀器

LPS（由Sigma公司生產），生理鹽水（由山東華魯制藥有限公司生產），正置顯微鏡（由0lympus 公司生產），組織脫水機（由湖北康強醫療器械有限公司生產），石蠟包埋機（由湖北泰維科技視野有限公司生產），石蠟切片機（由徠卡公司生產），IMS圖像分析系統（由武漢華聯科生物技術有限公司生產） ，PBS緩沖液（由無錫傲銳東源生物科技有限公司生產），10%的中性福爾馬林（由Solarbio公司生產），無水乙醇（由上海潤捷化學試劑有限公司生產），二甲苯（由上海潤捷化學試劑有限公司生產），蘇木素（由BASO公司生產），伊紅（由BASO公司生產），石蠟（由Leica公司生產）。

1.3 分組及動物模型構建

將24只SD大鼠分為LPS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組（合稱為LPS處理組大鼠）和對照組，每組各有8只大鼠。讓三組大鼠禁食12～14 h后，用10%的水合氯醛對其實施麻醉。麻醉起效后，固定大鼠，使其腹部朝上。將細軟管針輕輕插入大鼠的陰道內，分別向LPS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組和對照組大鼠的宮腔內注入100 μL濃度為10 mg/mL的LPS、濃度為20 mg/mL的LPS和生理鹽水，完成建模操作。待三組大鼠清醒后，將其放回籠內進行常規喂養及持續觀察。建模完成后48 h，將大鼠處死，取其血清及子宮。將每只大鼠的Y型子宮分成2份備用，將其中一份子宮浸泡于4%的多聚甲醛中進行固定。對子宮標本進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用IMS圖像分析系統測量三組大鼠子宮內膜的厚度。在光鏡下觀察三組大鼠子宮內膜的厚度、腺體和血管的分布情況、各層細胞的形態學改變等。對三組大鼠的子宮標本進行免疫組化染色，觀察CK19和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在子宮內膜及基層等部位的表達情況。

1.4 觀察指標

觀察造模后三組大鼠的一般情況（包括體重、子宮的外觀、形態等）。觀察造模后三組大鼠子宮的組織形態學特點及子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況。

1.5 統計學方法

用GraphPad Prism 8軟件對本研究中的數據進行處理，各組動物的體重等實驗結果以平均值±標準誤差（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后三組大鼠的一般情況

造模后，三組大鼠的體重無明顯差異（詳見圖1）。造模前對三組大鼠進行觀察發現，其子宮外觀呈粉紅色，粗細均勻，有彈性和光澤。造模后，LPS處理組大鼠的子宮發白，質地變硬，對照組大鼠子宮的顏色及形態無明顯變化。

圖1 造模后三組大鼠體重的比較

2.2 造模后三組大鼠子宮的組織形態學特點

造模后，與對照組大鼠相比，LPS處理組大鼠的子宮內膜層明顯變薄，宮腔腔隙增大，與肌層界限不清楚；其子宮內膜上皮和腺上皮細胞扁平化，內膜上皮細胞排列紊亂，間質充血水腫，腺體數量明顯減少；LPS 20 mg/mL組大鼠子宮內膜層變薄尤為明顯。詳見圖2。

圖2 造模后三組大鼠子宮的組織形態學特點

2.3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況

CK19在正常大鼠子宮內膜上皮細胞中呈高表達。造模后，對照組大鼠子宮內膜上皮細胞中的CK19呈強陽性表達，在子宮肌層中也有表達，但主要以內膜上皮細胞表達為主；LPS處理組大鼠子宮內膜上皮的正常結構遭到破壞，上皮細胞結構不清，其子宮內膜上皮細胞中CK19的表達弱于對照組大鼠，且CK19在子宮肌層中的表達也弱于對照組大鼠；隨著LPS劑量的增大，大鼠子宮內膜損傷破壞程度逐漸加劇，其子宮內膜上皮細胞中CK19的表達逐漸越低。造模后，對照組大鼠子宮內膜的結構較為完整，其子宮內膜和肌層中TNF-α的表達水平較低；LPS處理組大鼠的子宮內膜出現不同程度的損傷，TNF-α在其子宮內膜和肌層中均有表達；隨著LPS誘導劑量的加大，大鼠子宮內膜和肌層中TNF-α的表達水平逐漸升高；LPS處理組大鼠子宮內膜和肌層中TNF-α的表達水平顯著高于對照組大鼠。詳見圖3。

圖3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況

3 討論

子宮內膜炎、宮腔粘連、子宮疤痕、子宮內膜過薄、子宮內膜血供減少等子宮病變被臨床上認為是引起RIF的主要因素之一。上述子宮病變可直接影響受精卵的著床及輔助生殖過程中孕卵移植的成功率。研究指出，子宮內膜過薄是導致部分育齡女性不孕的原因之一，而RIF是影響輔助生殖技術成功率的重要因素。單純子宮內膜過薄患者和RIF患者都會因子宮內膜的容受性下降、子宮內膜局部血供減少而影響胚胎的著床，進而可導致其不孕。目前，通過改善子宮內膜的修復機制增加子宮內膜的血供，進而改善子宮內膜容受性的方法尚未見相關的研究報道。近年來，國內外的相關研究已嘗試建立子宮內膜損傷研究的動物模型（所選實驗動物主要有大鼠、小鼠、新西蘭兔、恒河猴等，造模方法有機械性損傷法、化學損傷法、熱損傷法、感染性損傷法、缺血性損傷法、電磁波損傷法及聯合損傷法等），但尚未獲得相對可靠的動物模型，且尚無針對子宮內膜損傷程度及子宮內膜損傷動物模型預后的評價標準。現階段，建立單純薄型子宮內膜動物模型的方法主要為高濃度乙醇宮腔注射損傷法[1]，也有學者通過熱損傷法建立薄型子宮內膜動物模型[2]。有研究通過宮腔放置銅絲和機械搔刮造成的雙重損傷構建新西蘭兔宮腔粘連模型[3]、小鼠子宮內膜損傷粘連模型[4-5]等多種動物模型。本課題采用LPS宮腔灌注誘導法建立大鼠子宮內膜損傷模型[6]，效果顯著，建模時間和LPS的用量均可控。該方法較細菌感染法、電損傷法等建模方法有明顯優勢[7]。大鼠的子宮由外至內可分為漿膜層、肌層和內膜層，其中內膜層最厚。大鼠子宮的組織結構與人類相似，均由不同作用的功能層和基底層組成，故本實驗采用SD大鼠進行造模。

本實驗的結果證實，LPS可有效地誘導大鼠子宮內膜損傷，LPS的最佳誘導劑量為20 mg/mL。LPS可作為一種損傷誘導劑成功構建大鼠子宮內膜損傷模型。