高效液相色譜法測(cè)定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮的不確定度分析

程紅新 陸軍

【摘要】 本文對(duì)高效液相色譜法測(cè)定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮含量進(jìn)行了不確定度分析，計(jì)算出樣品含量為0.000991%時(shí)的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

【關(guān)鍵詞】 不確定度;甲基氯異噻唑啉酮;化妝品;高效液相色譜法

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.017

Analysis of Uncertainty in Determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in Cosmetic

CHENG Hong-xin，LU Jun

（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract： The uncertainty of determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in cosmetic using high performance liquid chromatography was analyzed in this paper. When the 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one content in the sample was 0.000991%，the combined uncertainty and extended uncertainty were calculated.

Key words： uncertainty;5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one;cosmetic;high performance liquid chromatography

化妝品中因含有大量的水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易滋生細(xì)菌、真菌等微生物，故一般使用防腐劑，確保其使用安全。甲基氯異噻唑啉酮（5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one，簡(jiǎn)稱MCI）與甲基異噻唑啉酮（2-methylisothiazol，簡(jiǎn)稱MI）的混合物作為一種防腐劑，被廣泛應(yīng)用在淋洗類化妝品中，商品名為卡松。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）準(zhǔn)用防腐劑列表中卡松最大允許使用濃度僅為0.0015%，其中這兩種成分的質(zhì)量比約為m（MCI）：m（MI）=3：1，并常含有少許氯化鎂及硝酸鎂作為穩(wěn)定劑。近年來(lái)，對(duì)化妝品督抽驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分化妝品防腐劑卡松的添加量在規(guī)定限值的上限附近。因此，測(cè)量其不確定度對(duì)判定產(chǎn)品是否合格影響顯得尤為重要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

L-2000型高效液相色譜儀（帶有二極管陣列檢測(cè)器，日立公司）;

XS105 DU 電子天平（d=0.01 mg，METTLER TOLEDO）;

BECKMAN Avanti J-E型離心機(jī);

AS3120A型超聲波清洗儀;

Millipore-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）;

PHS-3C酸度計(jì)（上海精科）。

1.1.2 試劑

甲基氯異噻唑啉酮：純度98.4%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇，色譜純;磷酸氫二鈉，優(yōu)級(jí)純;乙腈，色譜純;氯化十六烷基三甲胺，優(yōu)級(jí)純;0.45 μm微孔濾膜（美國(guó)Millipore公司）

1.2 環(huán)境條件

溫度：（20±5） ℃，相對(duì)濕度：≤70%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品中的甲基氯異噻唑啉酮組分經(jīng)甲醇提取，用高效液相色譜儀分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

1.3.1 樣品處理

稱取樣品1 g（精確到0.0001 g）至具塞比色管中，加甲醇至10 mL，振搖，超聲提取15 min，離心，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)溶液，供液相色譜測(cè)定，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉+甲醇+乙腈（50+35+15），加氯化十六烷基三甲胺至最終濃度為0.002 mol/L，并用磷酸調(diào)pH至3.5;流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

樣品中甲基氯異噻唑啉酮含量的計(jì)算公式為：

[ω=C×V×10-4m×100%] （1）

式中：[ω]——樣品中甲基氯異噻唑啉酮含量，%;

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到待測(cè)組分的質(zhì)量濃度，μg/mL;

V——樣品定容體積，mL;

m——樣品取樣量，g。

2.2 測(cè)量不確定度的來(lái)源

根據(jù)甲基氯異噻唑啉酮檢測(cè)方法，分析不確定度的主要來(lái)源有：樣品稱量引入的不確定度，樣品定容引入的不確定度，待測(cè)液中甲基氯異噻唑啉酮的濃度引入的不確定度，重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。

2.3 測(cè)量不確定度分量的計(jì)算

2.3.1 樣品稱量引入的不確定度

本方法稱樣量為1.000 g，測(cè)定使用電子分析天平準(zhǔn)確至0.1 mg，根據(jù)電子分析天平校準(zhǔn)證書(shū)，在50 g量程范圍內(nèi)，該天平的最大允差是0.2 mg，按均勻分布k=[3]計(jì)算則樣品稱量引起的相對(duì)不確定度為：[ur（樣m）=0.2k=0.23=0.115 mg]，則樣品稱量引入的不確定度為：[ur（樣m）=0.1151000=0.000115]，其他因素引入的不確定度較小，可以忽略不計(jì)。

2.3.2 樣品定容體積引入度的不確定度

樣品定容，10 mL具塞比色管定容體積引入的不確定度是由量器校準(zhǔn)和溶劑與量器校準(zhǔn)時(shí)的溫差引入的。經(jīng)查JJG 11-1987標(biāo)準(zhǔn)，10 mLA級(jí)具塞比色管容量允差為±0.1 mL，取均勻分布，k=[3]，則[ur（樣V1）=0.1k×10=0.13×10=0.00577];實(shí)驗(yàn)室的溫度在20±5 ℃，溫度變化引起的不確定度可通過(guò)甲醇體積膨脹系數(shù)（1.2×10-3 ℃-1）與溫度變化來(lái)進(jìn)行計(jì)算，取均勻分布k=[3]，不確定度為：[ur（樣V2）=0.0012×53=0.00346];樣品定容體積引入的相對(duì)不確定度是：[ur樣V=（u2r樣V1+u2r樣V2=0.00673]。

2.3.3 待測(cè)試樣甲基氯異噻唑啉酮濃度引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度ur（標(biāo)p）

從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)查得甲基氯異噻唑啉酮的擴(kuò)展不確定度，[Ur=0.31%]（k=2），[ur標(biāo)p=0.00155]。

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度ur（標(biāo)m）

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量采用精度d=0.01 mg的電子天平，稱取標(biāo)準(zhǔn)品甲基氯異噻唑啉酮20.74 mg。根據(jù)儀器計(jì)量檢定證書(shū)結(jié)果，在5 g量程范圍內(nèi)，天平示值誤差為0.01 mg，則其區(qū)間半峰寬度為0.01 mg，按均勻分布k=[3]計(jì)算，則[u（樣m）=0.01k=0.013=0.00577] mg。則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度[ur（標(biāo)m）=0.00577/20.74=0.000278]。

2.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度ur（標(biāo)v）

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度主要來(lái)源于量具誤差和環(huán)境溫度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程：準(zhǔn)確稱取適量甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)品20.74 mg至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，即得甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;用1 mL移液器吸取甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容混勻，得甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。用1 mL移液器分別吸取甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0.5 mL、1 mL，用5 mL移液器分別吸取甲基氯異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液2 mL、4 mL、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容混勻，得系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

經(jīng)查甲醇體積膨脹系數(shù)為1.20×10-3 ℃-1，根據(jù)移液器和常用玻璃量器檢定規(guī)程規(guī)定的最大允許誤差，按照下面公式計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

[ur（V校準(zhǔn)）=a校準(zhǔn)k×V] （2）

[ur（V溫度）=a溫度k×V] （3）

式中：[a校準(zhǔn)]——量具校準(zhǔn)引起的體積偏差;

[a溫度]——溫度波動(dòng)引起的體積偏差，等于溫度波動(dòng)×體積膨脹系數(shù)×使用體積;

K——[3]（按均勻分布計(jì)算）;

V——標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度見(jiàn)表1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

[ur標(biāo)V=0.003652×5+0.003512×2+0.006732+0.006732×2+0.004512+0.004892+0.004892=0.0172]

2.3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur（[x]）

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的每一個(gè)濃度測(cè)定2次，得到相應(yīng)的響應(yīng)值，用最小二乘法擬合，擬合結(jié)果見(jiàn)表2。

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2] （4）

[SXX=i=1n（ci-c0）2] （5）

[Sy=i=1n[yi-（α+bci）]2n-2] （6）

式中：S[y]——峰面積的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差;

[yi]——各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)的儀器響應(yīng)值;

[α]——校準(zhǔn)曲線的截距;

b——校準(zhǔn)曲線的斜率;

m——曲線點(diǎn)數(shù)，每個(gè)點(diǎn)測(cè)量2遍，m=2×5=10;

ci——校準(zhǔn)曲線系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度。

校準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2=847.54477612+110+0.991-1.22421.667=0.0120]

其中，m=n×重復(fù)次數(shù)（n為標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)5，重復(fù)次數(shù)2次）;p為待測(cè)樣品的重復(fù)測(cè)定次數(shù)，p=2;[c0]為標(biāo)準(zhǔn)系列各點(diǎn)濃度的平均值=1.224 μg/mL;[x]為待測(cè)樣品濃度的平均值（0.991 μg/mL），由式（6）計(jì)算得[Sy=847.5]，由式（4）計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[u（x）=0.0120]，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：[ur（x）0.0120/0.991=0.0121]。

2.3.4 液相色譜儀引入的不確定度u（儀）

由高效液相色譜儀校準(zhǔn)證書(shū)查得：定量測(cè)量重復(fù)性RSD=0.60%，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.60%，按均勻分布計(jì)算[k=3]，[ur（儀）=0.0063=0.00346]。

2.3.5 重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將同一樣品重復(fù)測(cè)定6次，得到相應(yīng)的峰面積及濃度，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)偏差公式[sc=i=1nci-c2n-1]計(jì)算，[sc=0.00179]。

則被測(cè)樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：[ur（樣ω）=Scx=0.001790.990=0.00181]。

2.4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

測(cè)量模型中輸入量估計(jì)值相互獨(dú)立，將各項(xiàng)不確定度的分量進(jìn)行合成，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

[ur（ω）=u2r樣m+u2r樣v+u2r標(biāo)p+u2r標(biāo)m+u2r標(biāo)v+u2rlx+u2r儀+u2r樣ω=]

[0.0001152+0.006732+0.001552+0.0002782+0.01722+0.01212+0.003462+0.001812=0.0225]

2.5 擴(kuò)展不確定度

該測(cè)量誤差分布屬正態(tài)分布，在95%置信水平，包含因子k=2，則甲基氯異噻唑啉酮的擴(kuò)展不確定度[Ur（ω）=k×ur（ω）=2×0.0225=0.0450]，[U（ω）=ωUr（ω）= 0.000991%×0.0450= 0.000045%]。

2.6 甲基氯異噻唑啉酮檢驗(yàn)結(jié)果

甲基氯異噻唑啉酮含量為：0.000991%±0.000045%，k=2。

3 結(jié)語(yǔ)

由以上評(píng)定結(jié)果可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響最大。用高效液相色譜法測(cè)定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮含量，當(dāng)樣品中甲基氯異噻唑啉酮為0.000991%時(shí)，擴(kuò)展不確定度為0.000045%。根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）化妝品準(zhǔn)用防腐劑（表4）規(guī)定，甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮與氯化鎂及硝酸鎂的混合物（甲基氯異噻唑啉酮：甲基異噻唑啉酮為3∶1）最大允許添加濃度為0.0015%，計(jì)算甲基氯異噻唑啉酮最大允許添加濃度僅為0.001125%。

【參考文獻(xiàn)】

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[2]??? 蘇哲，林慶斌，王鋼力，等.化妝品防腐劑甲基異噻唑啉酮的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及技術(shù)法規(guī)要求最新進(jìn)展[J].香料香精化妝品，2019（1）：78-82.

[3]??? 化妝品安全技術(shù)規(guī)范[S].

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[5]??? 常用玻璃量器：JJG 196-2006[S].

[6]??? 移液器：JJG 646-2006[S].

[7]??? 專用玻璃量器：JJG 10-2005[S].

【作者簡(jiǎn)介】

程紅新（1966-），女，高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称坊瘖y品檢測(cè)，手機(jī)號(hào)碼：13252821380，E-mail：sychx66@163.com。

陸軍（1968-），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称坊瘖y品檢測(cè)。