五花解毒顆粒微生物限度檢查方法驗證

謝寧 蔡妮娜

【摘要】 目的：建立五花解毒顆粒微生物限度檢查方法。方法：對樣品進行5種試驗菌株的回收率試驗及控制菌檢查法的驗證來確定適宜的檢查方法。結果：各試驗菌的回收比值在0.5～2之間，控制菌檢查中試驗組可檢出試驗菌。結論：可采用常規法進行五花解毒顆粒的微生物限度檢查。

【關鍵詞】 微生物限度檢查;常規法;方法驗證

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.016

Methodology Validation of Microbial Limit Test of

Wuhua Jiedu Grain

XIE Ning，CAI Ni-na

（Nanning Hospital Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： Objective： To establish a method of microbial limit test of Wuhua Jiedu grain. Methods： The recovery tests of 5 bacterial strains and the me thodological validation of control bacteria examination method were done referring to the microbial limit test methods.Results： The recovery of the strain rate was 0.5～2，the experimental group were verified by test bacteria in the control bacteria detection. Conclusion： The Routine Method can be applied to the microbial limit test of Wuhua Jiedu Grain.

Key words： microbial limit test;routine method;method validation

五花解毒顆粒為固體口服制劑，處方含木棉花、金銀花、菊花、槐花、葛花，具有清熱解毒，涼血止痢的功效。根據《中國藥典》四部通則相關規定，本品需檢測需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，不得檢出大腸埃希菌。經方法學驗證，本品的微生物限度檢查方法符合規定，方法可行。

1 實驗用品

1.1 菌種名稱及來源

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，均購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 樣品

五花解毒顆粒批號：180425、180427、180509。生產廠家：南寧市中醫醫院。

1.3 稀釋劑及培養基

稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

培養基：沙氏葡萄糖瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基。均購于北京三藥科技開發公司。

1.4 儀器

立式壓力蒸氣滅菌鍋（LDZX-30FBS）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9246A）、潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）、生物安全柜（11231 BBC 86）、微機生化培養箱（SPX-15OB-Ⅱ）、生化培養箱（SPX-200-Ⅱ）、電熱恒溫培養箱（DHP-360）等。

2 計數方法的驗證

2.1 菌液制備

用0.9%氯化鈉溶液將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的新鮮培養物制成適宜濃度的菌懸液，備用;用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉孢子懸液制成適宜濃度的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備

1）取供試品10 g，用稀釋劑加至50 mL，制成1∶5的供試液。

2）取供試品10 g，用稀釋劑加至100 mL，制成1∶10的供試液。

2.3 驗證試驗方法

試驗組：取2.2中2）項下1∶10供試液5份，每份9.9 mL，分別加入0.1 mL的各試驗菌液，混勻，使含菌量不大于100 cfu/1 mL，取1 mL注皿，傾注相應的培養基，需氧菌置30～35 ℃培養3天，霉菌置20～25 ℃培養5天。

陽性組：取稀釋液代替供試液，方法同試驗組。

供試品組：取供試液，以稀釋液代替菌液，方法同試驗組。

2.4 方法的確定

經查詢，部分處方藥味對銅綠假單胞菌有不同程度的抑制作用，用銅綠假單胞菌進行預試驗，結果見表1。

結果表明，供試液濃度為1∶5時，銅綠假單胞菌的回收比值小于0.5，供試液稀釋到1∶5濃度時未能消除樣品的抑菌性，方法不可行。供試液濃度為1∶10時，銅綠假單胞菌的回收比值達到要求，取供試液濃度1∶10以平皿法-傾注法測定五花解毒顆粒需氧菌總數應可行。

2.5 計數方法的驗證試驗

取三批次五花解毒顆粒按2.2中2）項下制備供試液，按2.3驗證試驗方法進行加菌回收，結果見表2。

結果表明，以常規法進行試驗，五個試驗菌的回收比值均在0.5～2之間，符合藥典規定。

五花解毒顆粒的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法確定為制成1∶10供試液的常規法。

3 控制菌檢查方法的驗證

菌液制備同2.1。供試液制備同2.2中2）。

1）試驗組：取10 mL的1∶10供試液，直接接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基，加入大腸埃希菌（不大于100 cfu），30～35 ℃培養18小時。取1 mL培養物接種至100 mL麥康凱液體培養基，42～44 ℃培養24小時，用接種環沾取培養物，在麥康凱瓊脂平板上劃線接種，30～35 ℃培養18小時。

2）陽性組：取大腸埃希菌（不大于100 cfu）接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，同試驗組操作。

3）陰性組：以稀釋液代替供試品液，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，同試驗組操作。

試驗結果見表3。

結果表明，取規定量樣品接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，依法檢查，可檢出所加大腸埃希菌。

4 討論

為保證微生物限度檢查方法的科學性和檢查結果的準確性，中國藥典規定藥品的微生物限度檢查方法需通過方法適用性試驗加以驗證，從而真實反映藥品的質量。2010年版《中國藥典》微生物計數中明確要求進行三次獨立的平行試驗進行方法驗證，2015年版《中國藥典》微生物計數法未對試驗次數提出具體要求。參照2010年版要求，無論是采用一批樣品進行3次試驗，還是采用3批樣品各進行一次試驗，其目的都是為了說明操作中樣品的抑菌性是否存在消除不徹底的現象，保證方法的重現性。通過對三批樣品的方法驗證，可采用常規法對五花解毒顆粒進行需氧菌、霉菌和酵母菌的計數及控制菌檢查。

【參考文獻】

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[3]??? 國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術指南[M].北京：中國醫藥科技出版社，2017：568-569.

【作者簡介】

謝寧（1980-），女，學士，研究方向為制劑檢驗和質量標準。