MutT同系物1抑制劑對多發性骨髓瘤細胞增殖和凋亡的影響

靳娟娟，姚 玉

(銅川市人民醫院血液科,陜西 銅川 727100)

多發性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)屬于原發性的惡性漿細胞腫瘤，是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大惡性血液系統疾病[1]，起因是B淋巴細胞在體內異常繁殖,克隆漿細胞產生大量單克隆免疫球蛋白或其片段不斷蓄積，導致機體多個臟器發生損傷[2]，嚴重危及患者生命安全。最新研究[3-5]表明，該病發病率呈逐年上升趨勢，占全身惡性腫瘤發病率的10%～13%，在美國全身惡性腫瘤病例中，MM占1.5%，多數患者生存期少于10年，除此之外，該疾病呈現明顯的年輕化特點。目前MM治療藥物多為糖皮質激素，有良好的抗炎及免疫抑制作用，可顯著改善患者預后、延長生存期，但長期使用上述藥物不僅加重患者的經濟負擔而且易產生耐藥性[6-7]，因此探索新的靶點、新機制成為目前急需解決的問題。MutT同系物1(MutT homolog 1,MTH1)是近年來研究較多的一種焦磷酸酶[8]，存在于脫氧核糖核苷酸三磷酸池中，能糾正活性氧過量引起的氧化損傷，防止細胞衰老、死亡，導致細胞惡性增殖。大量研究[9-10]表明，MTH1在正常細胞中是非必需的，但在腫瘤細胞中是必需的，且在非小細胞癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤疾病組織中呈現高表達，因此，近年來MTH1惡性腫瘤的新靶點已成為腫瘤治療的主要研究方向。研究[11]表明MM組織中MTH1高表達，MTH1會影響腫瘤的發生、發展。本文主要通過探究MTH1抑制劑對多發性骨髓瘤細胞增殖、凋亡的影響，為進一步闡明MTH1抑制劑治療MM的作用機制提供一定的證據支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 試劑：多發性骨髓瘤細胞株U266購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，胎牛血清[125 ml,Absin(上海)生物科技有限公司]，MTH1抑制劑TH588試劑(5 mg,美國Cheme Gen 生物科技公司)，CD138磁珠購于德國美天旎Miltenyi生物科技公司，人外周淋巴細胞分離液(200 ml,P8900,北京索萊寶生物科技有限公司)，Trizol試劑(100 ml，北京百奧萊博科技有限公司)，熒光素酶底物(10 mg/50 mg，美國Goldbio公司)，上述試劑按照貯存條件進行分裝保存。儀器：實時定量基因擴增熒光檢測Q-PCR儀(Quant Studio 5，德國賽默飛公司)，高速離心機(TD-5M，山東博科科學儀器有限公司)，酶標儀(Multiskan FC，德國賽默飛公司)，流式細胞儀(Cyto Flex，貝克曼庫爾特公司)，反轉錄試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自德國賽默飛公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養：將多發性骨髓瘤U266細胞從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴箱中解凍。完全融化后，吸取凍存液于含15%胎牛血清的培養液中，于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養箱中培養，每2～3 d更換1次培養液，顯微鏡下觀察細胞處于對數生長期時可開展實驗。

1.2.2 MTH1抑制劑TH588對細胞增殖的影響：取MM U266細胞鋪滿整個48孔培養板(5×103個/孔)，進行轉染，每孔100 μl培養液。按照0.0、1.5、3.0、6.0、9.0 μmol/L的TH588的濃度梯度，將所有培養板分成五組，每組3板，置于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養箱中培養72 h，分別于0、48、72 h后每孔避光加入10 μl的熒光素底物，采用Multiskan FC酶標儀測定各時間點每孔懸液的熒光強度。同時，另取MM U266細胞轉染于24孔培養板上，加入上述濃度梯度的MTH1抑制劑TH588，于0、48、72 h后，用Trizol試劑提取RNA進行反轉錄，Q-PCR擴增儀檢測MTH1表達水平的變化情況。

1.2.3 MTH1抑制劑TH588對細胞凋亡的影響：取1.2.1中多發性骨髓瘤U266細胞轉染于24孔培養板上，加入上述濃度梯度的MTH1抑制劑TH588，于72 h后收集細胞，采用Ca2+依賴的磷脂結合蛋白(Annexin V)合并碘化丙啶(PI)染色法共同捕獲凋亡細胞，采用流式細胞儀進行分析，當對該方法呈雙陰性結果時，說明該細胞為活細胞，未發生凋亡。

2 結 果

2.1 MTH1抑制劑TH588對多發性骨髓瘤細胞株U266增殖的影響 見表1、2。通過提取RNA進行Q-PCR擴增，檢測每孔懸液的熒光強度及不同濃度抑制劑作用下MTH1表達水平的變化情況，結果表明，同一濃度隨時間延長熒光強度增強，不同濃度下隨TH588濃度的升高，熒光強度有所降低，且均顯著低于0.0 μmol/L濃度組(均P<0.05)；MTH1的表達水平隨時間延長也表現出明顯升高趨勢，同一時間點經TH588處理組表達顯著低于0.0 μmol/L濃度組，隨著TH588的濃度升高，MTH1表達水平呈明顯降低趨勢，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。

表1 不同濃度TH588作用于U266細胞熒光強度比較

2.2 MTH1抑制劑TH588對多發性骨髓瘤細胞株U266凋亡的影響 見表3。采用Annexin V/PI雙染色法測定TH588對MM U266細胞凋亡特性的影響，結果表明，隨TH588濃度的升高，Annexin V/PI染色雙陰性細胞的比例顯著降低，且濃度越高，降低越明顯，與0.0 μmol/L組相比存在統計學差異(P<0.05)。

表2 不同濃度TH588作用于U266細胞后MTH1的表達量

表3 不同濃度TH588對U266細胞凋亡的影響(%)

3 討 論

MM是一種漿細胞惡性增生血液系統疾病，臨床表現為貧血、急慢性腎衰竭、凝血功能障礙、高鈣血癥、溶骨性骨質破壞等癥狀[11-12]，嚴重危及患者生命安全。糖皮質激素是目前報道最多的治療MM的藥物，通過刺激骨髓瘤細胞產生抗炎及免疫抑制作用[13-14]，與蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑等靶向藥物共同作用，改善患者生存質量，但該治療方法存在耐藥性缺陷，因此探索新的靶點、新機制是目前臨床治療MM的主要研究方向[15]。MTH1是焦磷酸酶NUDIX家族一員，能減少活性氧過量對鳥嘌呤造成的氧化損傷，即水解8-氧代-dGTP成單磷酸形式，阻止細胞氧化衰老，是肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的新靶點[16]。因此，本文主要探索MTH1及其抑制劑TH588對MM細胞增殖、凋亡的影響，為開發新的治療靶點提供證據支持。

Satomi等[17]報道顯示，MTH1作為腫瘤細胞常見靶點，在多種癌癥疾病組織中呈現高表達的特點，進一步說明MTH1表達水平與MM具有明顯的相關性，也驗證了本實驗選取MTH1抑制劑TH588對細胞生物特性有一定的合理性。

通過檢測熒光強度探究TH588對細胞生物特性的影響，本實驗將不同濃度TH588直接作用于對數生長期的MM U266細胞，熒光測定結果顯示，TH588濃度越高熒光強度越低，表明TH588能夠明顯的抑制U266細胞增殖。Petrocchi等[18]研究發現TH588抑制肺癌腫瘤細胞的增殖可能與抑制細胞有絲分裂G2期DNA的復制、細胞分裂期以及酶與紡錘絲蛋白質的合成有關。研究[7]發現MTH1自身不是正常細胞必需的蛋白，能防止細胞進入正常的氧化衰老、凋亡過程，導致細胞惡性增殖，而TH588能明顯抑制U266細胞中MTH1的表達，對臨床開發新靶點的蛋白酶抑制劑治療MM有一定的指導意義。

最后Annexin V/PI雙染色凋亡實驗表明，TH588濃度越高，雙陰性細胞比例越低，說明該細胞膜未破損，染色劑未進入細胞內部，且該U266細胞為活細胞，其比例越低表明TH588濃度越高，對U266細胞的破壞率越高，從而促使腫瘤細胞凋亡最終達到治療疾病的目的；吳曉波等[19]、Stewart等[20]通過探究TH588對乳腺癌腫瘤細胞生物特性的影響也發現該抑制劑能誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖。雖然目前對正常細胞的毒性作用尚不清楚，但作為U266細胞新靶點的抑制劑，TH588具有一定的臨床開發價值。

綜上所述，MTH1抑制劑TH588表現出顯著的抑制U266細胞增殖并促進其凋亡的作用，且有明顯的量效關系，此為臨床開發治療MM的新靶點藥物提供了實驗依據。