小檗堿抑制人卵巢癌細胞HO-8910體外增殖機制研究

孫 育，劉朝陽，劉英潔

(西北婦女兒童醫院，陜西 西安 710061)

卵巢癌發病率僅次于子宮體癌和子宮頸癌，是女性生殖器官最難治療的惡性腫瘤之一[1]，嚴重影響廣大患者的生活質量和壽命。卵巢上皮癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，其病死率在各類婦科腫瘤中排首位，對女性生命造成嚴重威脅[2-3]。由于直到癌癥廣泛擴散臨床上才可能觀察到癥狀，因此在該疾病的早期階段診斷僅僅占所有患者的四分之一。目前，手術與細胞毒性化學療法相結合可在超過一半以上的患者中產生良好的臨床反應[2]。紫杉醇和鉑類是該聯合治療方案中使用的兩種藥物。但大多數患者接受紫杉醇和鉑類聯合治療后，最終仍會復發[4]。腫瘤常見的治療方法如手術切除、藥物治療和放射治療等均不能起到理想的治療效果[5]，基于此，尋求簡便易行且安全有效的治療方法極為重要。文獻[6]報道，中藥單體比如龍葵堿等具有抑制腫瘤細胞體外增殖的作用。另據文獻[7]報道從中藥黃連、黃柏中提取的小檗堿具有降血脂、抗癌、抗氧化等作用。最新研究[8]表明，小檗堿可以通過抑制血管生成進而促進癌細胞凋亡，但其對人卵巢癌上皮細胞體外增殖以及β-catenin信號通路的影響尚不清楚。本研究旨在探討小檗堿對人卵巢癌上皮細胞增殖的影響及其機制，藉此為防治卵巢癌尋找新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HO-8910細胞株(人卵巢癌上皮細胞)購自廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司。小檗堿購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，小檗堿溶于DMSO。DMEM培養基(美國Gibco 公司)、青霉素/鏈霉素雙抗(美國Gibco 公司)，CCK8試劑購于美國Apexbio公司，細胞周期檢測試劑盒(中國碧云天生物公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天生物公司)，細胞周期試劑盒試劑盒購于美國BD公司，Cyclin D1、 p21、β-catenin 和GAPDH 抗體均購于中國博士德生物公司，免疫組化試劑盒購于美國Cell Signal Technology有限公司。流式細胞儀購于美國BD Pharmingen 公司，轉膜儀(美國Bio-Rad 公司)，全自動酶標儀(美國Thermo 公司)，倒置顯微鏡(德國奧林巴斯公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：HO-8910細胞株由DMEM培養基培養在37 ℃，5% CO2培養箱中，DMEM 完全培養基包含1% 雙抗，10%胎牛血清，培養基3 d更換1次，細胞長勢達到70%～80% 時，對細胞進行消化、傳代和接種。

1.2.2 CCK8法檢測小檗堿對HO-8910細胞株活力的影響：將HO-8910細胞培養到對數期，消化并計數，按照3×103個/孔接種于96孔板中，向對應試驗孔中分別加入含有不同濃度的小檗堿(0、12.5、25、50、100 μmol/L)DMEM完全培養基,每個濃度組設3 個復孔，培養24 h后棄去培養基，將10 μl CCK-8染液加入到100 μl細胞培養液中，37 ℃條件下繼續孵育4 h，使用酶標儀在490 nm測量吸光度。

1.2.3 流式細胞法檢測小檗堿對HO-8910細胞周期分布的影響：將HO-8910細胞株以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養基，培養24 h后，消化轉移至離心管中，1000 r/min 離心5min。收集細胞，用預冷PBS在4 ℃冰箱固定4 h，參照試劑盒說明書的步驟檢測細胞周期。

1.2.4 Western blot 檢測小檗堿對HO-8910細胞增殖相關蛋白表達的影響：將HO-8910細胞株消化傳代，并以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養基處理24 h，倒掉培養基，參考BCA試劑盒進行蛋白質提取和蛋白濃度測定。每孔上樣30 μg，用半干轉膜儀轉膜，之后用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀釋液，將膜放入4 ℃冰箱搖床上，孵育過夜，次日加入TBST洗3 次，分別加入二抗(1∶3000)稀釋液，用ECL 發光液浸膜 5 min，用凝膠成像儀進行顯色反應并拍照記錄，用GAPDH作為內參，用Image Lab 3.0軟件進行條帶定量分析。

1.2.5 RT-PCR法：將HO-8910細胞株消化傳代，并以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養基，培養24 h后，收集培養24 h后的各組細胞，棄去培養基，采用Trizol法提取RNA。以cDNA為模板進行RT-PCR反應。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 的相對表達量，GAPDH作為內參，各引物序列見表1。

2 結 果

2.1 小檗堿對HO-8910細胞活力的影響 見圖1。當小檗堿濃度為12.5、25 μmol/L 時，小檗堿對HO-8910細胞株活性沒有顯著作用，當小檗堿濃度為50、100 μmol/L 時，小檗堿顯著抑制HO-8910細胞株活性，與對照組(0 μmol/L小檗堿組)相比，其組間差異有統計學意義(P<0.01)，本研究在后續實驗中選用50 μmol/L小檗堿為小檗堿組。

注：與0 μmol/L小檗堿組比較，**P<0.01

2.2 小檗堿對HO-8910細胞株細胞周期的影響 見表2。小檗堿組G0/G1期細胞百分比與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，小檗堿組中S期細胞百分比與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 兩組細胞周期分布比較(%)

2.3 小檗堿對HO-8910細胞株增殖相關蛋白 mRNA表達水平的影響 見圖2 。與對照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表達量顯著減少(P<0.05、P<0.01)，p21 mRNA表達量顯著增加(P<0.01)。

2.4 小檗堿對HO-8910細胞株增殖相關蛋白表達水平的影響 見圖3。與對照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表達量顯著減少(P<005、P<0.01)，p21蛋白表達量顯著增加(P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

卵巢癌是臨床婦科最常見和最棘手的惡性腫瘤之一，其難于早期發現且發病機制尚未完全清楚，因此，多年來卵巢癌病死率穩居婦科第一[9]。目前，手術、化療以及放療仍是臨床上主要的診治方法，但對患者具有較大的創傷和不良反應[10]，而中藥活性單體具有來源廣泛、廉價，治療安全有效的特點，未來中藥活性單體具有廣闊的應用前景。

小檗堿是一種生物堿，研究[11-12]發現小檗堿促進癌細胞凋亡是通過抑制巨噬細胞的形成介導的。本研究通過CCK8實驗和細胞周期實驗發現小檗堿可顯著抑制HO-8910細胞增殖，并抑制細胞從G0/G1期向S 及G2期細胞轉變。RT-PCR和Western blot探明了小檗堿可顯著抑制HO-8910細胞增殖的作用機制，即小檗堿抑制了HO-8910細胞株β-catenin、Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表達。文獻[13]報道，小檗堿通過降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65表達及提高Bax表達，有效抑制宮頸癌增殖及侵襲轉移并誘導其發生凋亡，小檗堿通過將細胞阻滯于G0/G1期，并能夠阻斷NF-κB信號通路，從而抑制子宮內膜癌的轉移[14]。本研究中，小檗堿通過抑制細胞從G0/G1期向S 及G2期細胞轉變進而抑制HO-8910細胞增殖這一結果與已報道的小檗堿可抑制卵巢癌細胞增殖及誘導細胞凋亡相符[15]。

Wnt/β-catenin一般通路較多參與腫瘤的形成和發展，決定著腫瘤細胞增殖和凋亡的去向[9]。β-catenin是Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵調控蛋白，在腫瘤中表達上調[16]，在各類細胞中起著粘連并傳遞信號的作用[17]，β-catenin與人類癌癥中的致癌活性有關。越來越多的證據表明，β-catenin參與了卵巢癌的發生、發展和轉移[18-19]。Cyclin D1在調節細胞周期進程中起著至關重要的作用。Lin等[20]發現了一個完美的T細胞因子4(Tcf4)結合位點(CTTGATC)，位于Cyclin D1啟動子區域中的核苷酸-80和-73之間，提示β-連環蛋白/Tcf4途徑可能參與了對T細胞因子4的調控下Cyclin D1表達。文獻[21]報道在乳腺癌細胞系中，β-catenin/Tcf4途徑參與細胞 Cyclin D1啟動子的激活。Cyclin D1和p21是細胞周期調控極為重要的調節因子，Cyclin D1主要參與細胞周期的基因突變和隨后細胞周期G1/S期的轉變[22]。p21 作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員之一，可通過與Cyclin/CDK 蛋白激酶復合體相結合而抑制酶的活性，p21對CDK的抑制會在細胞周期的G1和G2階段觸發細胞周期停滯[23]，p21基因既與腫瘤抑制作用密切相關，又能通過抑制周期素依賴激酶復合物活性，協調細胞周期、DNA復制與修復之間的關系，從而將腫瘤抑制作用與細胞周期控制過程緊密相連[24]。本研究中，小檗堿抑制了HO-8910細胞株Cyclin D1并促進p21的表達，導致細胞周期停滯在G1期，進而抑制了HO-8910細胞進一步增殖。此外，本研究的不足之處在于沒有檢測小檗堿對HO-8910細胞凋亡蛋白指標的影響，尚需進一步研究。

綜上所述，小檗堿可通過抑制細胞內周期蛋白表達抑制HO-8910細胞增殖。該結果為小檗堿的抗癌作用提供了堅實的實驗依據。