甜瓜幼果果皮顏色基因GR的精細定位

許昕陽，沈佳，張躍建，李國景，牛曉偉，壽偉松

甜瓜幼果果皮顏色基因的精細定位

許昕陽，沈佳，張躍建，李國景，牛曉偉，壽偉松

浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，杭州 310021

【】探究甜瓜幼果果皮顏色性狀的遺傳規(guī)律，精細定位目標性狀基因，加深對甜瓜發(fā)育過程中果皮顏色轉(zhuǎn)變的認知，為開展甜瓜果皮顏色的分子設(shè)計育種奠定基礎(chǔ)。以幼果深綠皮的薄皮甜瓜純系‘MR-1’和幼果淺綠皮的厚皮甜瓜純系‘LGR’為親本，構(gòu)建F1正反交群體；以及利用F1與淺綠皮親本‘LGR’雜交構(gòu)建BC1F1回交群體，對甜瓜幼果果皮顏色基因（）進行遺傳分析。選取BC1F1群體中深綠皮和淺綠皮單株各20株，混池其DNA進行BSA-seq以獲取初定位區(qū)間。基于‘MR-1’和‘LGR’兩親本的重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)初定位區(qū)段內(nèi)特異性較好的分子標記，鑒定篩選擴大群體（BC1F1和F2）中的重組交換單株，驗證和縮小定位區(qū)間，實現(xiàn)精細定位。將兩親本定位區(qū)段內(nèi)注釋基因的編碼區(qū)進行測序以確定候選基因和關(guān)鍵變異位點。通過調(diào)查BC1F1回交群體中幼果果皮顏色和成熟果果皮顏色，利用相關(guān)性分析探究果皮顏色轉(zhuǎn)變在甜瓜發(fā)育過程中的內(nèi)在聯(lián)系。通過分析F1群體果皮顏色發(fā)現(xiàn)所有F1單株幼果都表現(xiàn)為深綠皮。另外，BC1F1群體單株幼果果皮顏色會發(fā)生分離，其中深綠皮單株數(shù)﹕淺綠皮單株數(shù)約等于1﹕1，以及F2群體中深綠皮植株與淺綠皮植株的分離比為3﹕1。這些分離比都符合孟德爾遺傳定律，表明幼果果皮顏色是受單個核基因控制的質(zhì)量性狀，并且深綠對淺綠為顯性。通過BSA-seq分析將基因初步定位于4號染色體長臂，物理距離為1.8 Mb的范圍內(nèi)。利用開發(fā)的分子標記在擴大的定位群體中共篩選到24個重組交換單株。經(jīng)過后代基因型和表型驗證，最終將精細定位在標記4-102和4-81之間約17.7 kb的范圍內(nèi)，區(qū)段內(nèi)共包含4個注釋基因。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)一個編碼GLKs類轉(zhuǎn)錄因子CmAPRR2的基因在親本‘MR-1’和‘LGR’中存在多處變異，其中有3處發(fā)生了同義突變，1處錯義突變和1處無義突變。無義突變出現(xiàn)在的編碼區(qū)第856位堿基處（由G變成T），導致親本‘LGR’中蛋白翻譯提前終止，其Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失，推測基因（）即為影響甜瓜幼果果皮顏色的基因，而第856位的單堿基替換造成的無義突變即為關(guān)鍵變異位點。此外，BC1F1回交群體單株的表型調(diào)查結(jié)果顯示幼果與成熟果的果皮顏色之間存在顯著相關(guān)性。甜瓜幼果果皮顏色（深綠/淺綠）性狀為質(zhì)量性狀，受單個核基因控制。通過遺傳定位手段推斷（）為最有可能影響甜瓜幼果果皮顏色的候選基因。

甜瓜；幼果果皮顏色；基因定位；；（）

0 引言

【研究意義】甜瓜（L.）是我國重要的園藝和經(jīng)濟作物。果皮顏色作為甜瓜最直觀的外觀品質(zhì)性狀，直接影響其商品價值和消費者的選擇，開展甜瓜果皮顏色性狀的遺傳研究對甜瓜育種有重要意義。【前人研究進展】瓜類植物的果皮顏色調(diào)節(jié)開始于果實發(fā)育的早期，在幼果期表現(xiàn)為綠色，反映的是葉綠素含量[1]。隨著果實發(fā)育的進行，甜瓜外果皮顏色在成熟過程中會發(fā)生較大轉(zhuǎn)變[2]。成熟甜瓜果皮顏色豐富多樣，主要有白色、黃色、橙色、綠色以及多種顏色混雜或者斑紋類型。早期對甜瓜果皮顏色是由單基因或者多基因控制存在較大的爭議，但該爭議多基于不同品種間組合的差異[3-4]。KUBICKI[5]認為幼果果皮白色對綠色為顯性，并且是受單基因遺傳控制。PEREIRA等[6]通過構(gòu)建‘Védrantais’和‘Piel de Sapo’的高密度GBS遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)淺皮為顯性性狀，并且將該基因定位在7號染色體，該位置與相近，推測為同一個基因。BURGER等[7]利用兩個雜交群體：深皮‘Dulce’和淺皮‘TAM-Dew’，深綠‘Krymka’和淺綠‘Eshkolit Ha’Amaqim’探究甜瓜幼果果皮顏色遺傳模式時發(fā)現(xiàn)淺皮親本受隱性單基因控制，并且該基因與之前報道的淺皮顯性基因不等位。OREN等[8]利用‘Tam Dew’和‘Dulce’的重組自交系以及‘Dulce’和‘Noy Amid’的F3:4家系將一個影響甜瓜幼果果皮顏色的基因定位在4號染色體上290 kb的區(qū)段內(nèi)，后通過差異性分析確定基因是影響該幼果果皮顏色的基因。在成熟果中，HUGHES[9]發(fā)現(xiàn)‘Honeydew’品種的白色相對于‘Smiths’ Perfect cantaloupe’品種的綠色為隱性。TADMOR等[1]在黃皮‘Noy Amid’和綠皮‘TVT’雜交的F2分離群體中發(fā)現(xiàn)柚皮素查爾酮含量的分離比符合孟德爾3﹕1的遺傳定律，證實了該色素受單基因調(diào)控。FEDER等[10]進一步利用該F2群體進行了基因定位，并結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化鑒定出影響成熟果果皮顏色的基因。另外，利用‘Piel de Sapo’和‘PI 161375’的雜交組合，研究者們也鑒定了果皮顏色相關(guān)的QTLs[11-12]。【本研究切入點】隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，許多甜瓜果皮顏色相關(guān)的QTLs和基因被分離和鑒定。但是，多數(shù)基因的精細定位仍存在定位區(qū)間較大、候選基因眾多等情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究構(gòu)建薄皮甜瓜兩個幼果果皮顏色差異的純系甜瓜‘MR-1’和厚皮甜瓜‘LGR’雜交組合，對其進行表型觀察、群體構(gòu)建、遺傳模式分析、基因圖位克隆等，精細定位幼果果皮顏色基因，為深入揭示甜瓜幼果果皮顏色的形成機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用的材料‘MR-1’由國外引進，屬于薄皮甜瓜亞種泡瓜變種（var.），果實為近圓形；‘LGR’由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜所甜瓜研究室提供，屬于厚皮甜瓜亞種冬甜瓜變種（var.），果實為長橢圓型（圖1），成熟果有網(wǎng)紋[13-14]。利用兩個材料雜交構(gòu)建了正反交F1群體、F1與‘LGR’回交BC1F1群體，主要用于遺傳分析；BC1F1和F2群體主要用于BSA-seq和遺傳定位。雜交和回交構(gòu)建于2017年春季，定位群體種植于2017年秋季、2018年春秋、2019年春秋以及2020年春季。所有材料均種植在浙江海寧甜瓜實驗基地，采用常規(guī)大田生產(chǎn)管理。

1.2 果皮顏色性狀調(diào)查

兩親本甜瓜‘LGR’和‘MR-1’的幼果果皮顏色調(diào)查以花后10 d左右的果實為對象，利用目測對比顏色深淺，分別定為“淺綠色”和“深綠色”。遺傳分析和定位群體中單株的表型調(diào)查也以花后10 d左右的果實為對象，對照兩親本的幼果果皮顏色，經(jīng)3次不同時間（花后8、10和12 d）的目測定義表型。成熟果顏色調(diào)查和測色儀定量測定取自花后35 d左右的果實。利用美能達CR-400/410色彩色差計（Konica Minolta Camera Co., Ltd, Osaka, Japan）對果皮顏色定量，其中L*值代表亮度從黑（0）至白（100），a*值代表從紅（+a）至綠（-a），b*值代表從黃（+b）至藍（-b）。利用SPSS Statistics V21.0進行相關(guān)性分析。

1.3 BSA-seq分析

從BC1F1群體中挑選深綠皮和淺綠皮植株各20株，利用CTAB法提取DNA。將20個深綠皮和20個淺綠皮單株DNA分別等量混合，形成兩個混池。2個混池和2個親本DNA按照樣品檢測、文庫構(gòu)建、質(zhì)量檢測以及上機測序等流程送由公司操作。參考基因組為甜瓜基因組Harukei3 genome reference ver1.41（http://melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/jbh）。

1.4 分子標記開發(fā)

基于親本重測序信息，在初定位區(qū)段的雙側(cè)和內(nèi)部挑選有多態(tài)性的Indel標記，利用凝膠電泳鑒定分子標記的結(jié)合能力和特異性。后利用合適的引物對F2和BC1F1群體中的隱性單株個體進行基因型鑒定，驗證初步連鎖結(jié)果以及縮小定位區(qū)間。

1.5 DNA提取、PCR擴增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

取新鮮的甜瓜葉片于冷凍干燥機中放置1 d，采用CTAB法提取DNA：將葉片磨成粉末狀，加入600 μL預熱的CTAB提取液，搖勻，65℃水浴30 min；加入600 μL氯仿﹕異戊醇（24﹕1）抽提液，用力搖晃2 min后，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入360 μL（0.6倍體積上清液）-20℃預冷的異丙醇，-20℃中放置30 min；12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入700 μL 70%無水乙醇洗滌2次，晾干后溶于去離子水中，-20℃保存。

PCR擴增體系為10 μL，其中包括：2×buffer mix 5 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 2 μL，加去離子水2.4 μL。PCR反應程序：98℃預變性2 min，然后擴增33個循環(huán)（包括：94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 40 min），接著72℃ 5 min，4℃ 10 min。擴增好的樣品于4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 親本果皮顏色表型

通過對花后10 d的果皮顏色觀察，發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜‘MR-1’幼果果皮表現(xiàn)為深綠色，花后35 d的成熟果果皮表現(xiàn)為亮黃色；而厚皮甜瓜‘LGR’幼果果皮表現(xiàn)為淺綠色，成熟果果皮表現(xiàn)為灰色有網(wǎng)紋（圖1）。

2.2 幼果果皮顏色遺傳模式分析

為探究幼果果皮顏色的遺傳規(guī)律，以‘MR-1’和‘LGR’為親本進行正反交組配，所得F1代的幼果果皮顏色均與‘MR-1’表型相同，表明幼果果皮顏色受核基因控制，且深綠對淺綠為顯性（圖1）。F2群體植株的幼果果皮顏色發(fā)生分離，其中132個果實為深綠色果皮，44個果實為淺綠色果皮，符合3﹕1的孟德爾遺傳分離比，BC1F1代群體表現(xiàn)為1﹕1的分離比（表1）。這些結(jié)果表明幼果果皮顏色是受單基因控制的質(zhì)量性狀。因該基因主要控制果皮綠色的深淺，因此將其命名為（）。

圖1 親本以及正反交F1果皮顏色表型

表1 幼果果皮顏色表型的遺傳學分析

2.3 GR的初步定位

為了分離和克隆，首先通過從BC1F1群體中挑選淺綠色和深綠色果皮植株各20株進行DNA混池測序（BSA-seq）。參照兩親本的重測序信息，全基因組連鎖分析顯示4號染色體長臂上存在一個目標性狀區(qū)域（圖2）。該基因座的物理位置為203 744—1 974 725 bp，置信區(qū)間跨越1.8 Mb。

圖2 GR的初定位（紅圈代表目的區(qū)段）

2.4 GR的精細定位

基于親本重測序得到的覆蓋了13條染色體，共1 320 497個多態(tài)性分子標記，在4號染色體上開發(fā)位于初定位區(qū)間兩側(cè)的標記4-6和4-58，對BC1F1群體中的隱性單株（淺綠皮）進行基因型鑒定。結(jié)果顯示淺綠皮單株與標記4-6有十分明顯的共分離趨勢（圖3-A），證實了BSA初定位的結(jié)果。為了精細定位該基因，開發(fā)了初定位結(jié)果內(nèi)特異性好的引物（圖3-B，表2），并對擴大的BC1F1和F2群體共984株（BC1F1：877株，F(xiàn)2：107株）進行基因型鑒定，結(jié)果共篩選出24個重組交換單株（圖4-B）。通過對重組交換單株進行后代表型和基因型鑒定，最終將精細定位于標記4-102和4-81之間，物理距離為17.7 kb（Chr04: 602468-620197）（圖4-A、B）。

由于重組交換單株的缺乏，對17.7 kb區(qū)間內(nèi)包含的基因進行序列比對分析。根據(jù)最新的甜瓜參考基因組的基因注釋發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含了4個基因：2個新注釋基因（和）、1個完整注釋基因（）以及的一部分（圖4-C）。其中，編碼未知蛋白；預測編碼一個類生長素蛋白；編碼一個雙組分反應調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白屬于Golden2-like類轉(zhuǎn)錄因子，故被命名為CmAPRR2；編碼一個煙草花葉病毒復制蛋白。通過序列比對發(fā)現(xiàn)和等3個基因的編碼區(qū)序列在兩親本中存在差異（表3）。其中，僅存在由單堿基替換造成的錯義變異，除了3處同義突變和1處錯義突變，還存在1處單堿基替換造成的無義變異（表3）。通過對親本‘MR-1’和‘LGR’測序，證明‘LGR’中編碼區(qū)第856位堿基（G變?yōu)門）產(chǎn)生了終止密碼子，致使MELO3C003375蛋白翻譯提前終止，導致了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失（圖5）。在黃瓜、番茄以及西瓜中，的同源基因、以及被報道參與葉綠素和類胡蘿卜素的合成以及質(zhì)體發(fā)育等過程[8,15-16]。由此推測，（）為控制甜瓜幼果果皮顏色的基因，而單堿基替換造成的無義突變?yōu)樵斐蓛捎H本幼果果皮顏色深淺的關(guān)鍵差異位點。

A：隱性單株在分子標記4-6的基因型。泳道1為‘MR-1’，2為‘LGR’，8、19、58為重組交換單株；B：引物多態(tài)性。上方標記為引物名，每個引物左邊泳道為‘MR-1’，右邊為‘LGR’。M為DNA marker

表2 定位所用引物序列

A：GR初定位于4號染色體4-6和4-58標記之間；B：利用984個單株精細定位GR于4-102和4-81標記約17.7 kb范圍內(nèi)。標記下面的數(shù)字代表交換單株數(shù)；C：定位區(qū)間內(nèi)的候選基因

2.5 幼果果皮顏色與成熟果皮顏色存在顯著相關(guān)性

為探究甜瓜幼果果皮顏色與成熟果皮顏色之間的相關(guān)性，對BC1F1群體共153個單株的幼果進行目測，并對照親本將其劃分深綠（1）和淺綠（2）兩類。因成熟果果皮顏色變化差異較大，使用測色儀定量分析成熟果顏色變異（表4）。通過統(tǒng)計分析和相關(guān)性檢測，發(fā)現(xiàn)幼果果皮顏色與成熟果皮顏色的亮度指標和綠色強度指標的相關(guān)系數(shù)分別為0.849和0.857，呈極顯著相關(guān)。這說明幼果果皮顏色與成熟果果皮顏色存在顯著相關(guān)性。

表3 定位區(qū)段內(nèi)基因編碼區(qū)變異

參考和比對分別代表‘MR-1’和‘LGR’中堿基和翻譯氨基酸REF and ALT represent the base and amino acid in ‘MR-1’ and ‘LGR’, respectively

A：MELO3C003375的基因結(jié)構(gòu)。數(shù)字代表到轉(zhuǎn)錄起始位點的距離。前面的堿基代表‘MR-1’中的堿基，后面代表‘LGR’中的堿基；B：引起LGR蛋白截短的變異位點；C：‘MR-1’和‘LGR’中MELO3C003375的蛋白結(jié)構(gòu)域

3 討論

隨著甜瓜基因組研究的深入，功能基因組學取得了快速發(fā)展[17]。作為重要的農(nóng)藝性狀，果皮顏色的遺傳模式一直是研究者關(guān)注的熱點。4號染色體長臂被廣泛報道含有一個調(diào)控甜瓜果皮顏色的基因[8,18-20]。OREN等[8]利用3個親本‘Tam Dew’‘Dulce’和‘Noy Amid’將幼果果皮顏色基因定組位在4號染色體290 kb區(qū)段內(nèi)；ZHAO等[18]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）將果皮顏色基因定位于4號染色體500 kb的范圍內(nèi)。因該定位范圍內(nèi)含有一個編碼雙組分反應調(diào)節(jié)蛋白CmAPRR2的基因，且該基因的同源基因曾在黃瓜、番茄和胡椒中被報道可調(diào)控果皮的葉綠素代謝和色素積累，因此（）被前人認定為候選基因[8,18]。有別于前人使用厚皮甜瓜進行亞種內(nèi)組配，本研究利用厚皮與薄皮甜瓜開展亞種間雜交；同時，本研究的親本在果形、網(wǎng)紋以及成熟果果皮顏色等方面與前人選材存在較大差異，這不僅給該性狀的遺傳定位選材增添了新類型，也暗示了該基因功能在亞種間的保守性[8,13-14]。另外，本研究采用BSA-seq確定初定位區(qū)間、重測序開發(fā)新標記和圖位克隆縮小區(qū)段這一思路清晰且完整的研究方案，通過多代表型和基因型的驗證，將精細定位在17.7 kb的區(qū)間內(nèi)。但重組交換單株的缺乏使該區(qū)間較難進行進一步的縮小。通過對區(qū)間內(nèi)注釋基因的測序分析發(fā)現(xiàn)（）在‘LGR’中存在1處無義變異，致使該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的重要結(jié)構(gòu)域（Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）缺失，因此，（）被認為是最佳候選基因。相比以往報道，本研究極大地縮短了幼果果皮顏色性狀基因的定位區(qū)間，提高了（）作為候選基因的可信度。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)‘MR-1’親本中第二個外顯子處的單堿基變異與已報道的材料都不相同，這也為甜瓜中的變異類型增添了新認知。

表4 BC1F1群體植株果皮顏色表型

續(xù)表4 Continued table 4

-a*/b*代表綠色的強度 -a*/b* represents the intensity of green color

甜瓜果皮顏色豐富多樣，F(xiàn)ALLIK等[21]對不同成熟度的‘Galia’甜瓜進行了果皮顏色變化調(diào)查并將其分成6個階段：（1）深綠色；（2）綠色；（3）淡黃色夾雜綠色；（4）淡黃色；（5）黃色；（6）深黃色至橙色。REID等[22]通過評估‘Crenshaw’‘Persian’和‘PMR45’3個甜瓜品種發(fā)現(xiàn)果實的成熟會伴隨著葉綠素含量的下降和類胡蘿卜素的上升。而FLüGEL和GROSS[23]在‘Galia’甜瓜中觀察到類胡蘿卜素含量在發(fā)育期間并沒有變化，外果皮變黃主要是因為在成熟過程中葉綠素的降解增加。因此，果皮顏色變化被認為主要由葉綠素和類胡蘿卜素（主要是-胡蘿卜素）引起[24]。在本研究中，（）作為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因，其是否參與了單一色素或者組合色素的合成或者分解過程？在黃瓜中，被發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)體發(fā)育和葉綠素的合成[15]。PAN等[16]發(fā)現(xiàn)番茄和辣椒果實中過表達APRR類轉(zhuǎn)錄因子會增加幼果的葉綠素和成熟果的類胡蘿卜素。OREN等[8]發(fā)現(xiàn)的表達與-類胡蘿卜素的含量存在緊密的相關(guān)性。另外，與APRR2相關(guān)的GLK2轉(zhuǎn)錄因子也曾被報道影響質(zhì)體的發(fā)育以及調(diào)節(jié)植物的葉綠素和類胡蘿卜素的含量[25-27]。這些報道都為下一步比較分析親本色素含量提供了依據(jù)和方向。

作為雙組分反應調(diào)節(jié)蛋白（ARR）的一類，APRR2屬于B型響應調(diào)節(jié)蛋白，該類型的蛋白被廣泛報道參與細胞分裂素的信號轉(zhuǎn)導[28]。在的三突變體中，ARGYROS等[29]發(fā)現(xiàn)葉綠素的含量顯著減少并且大部分的細胞分裂素調(diào)節(jié)基因顯著下調(diào)。在擬南芥中，CHOI等[30]發(fā)現(xiàn)ARR2可通過Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TGA3互作，進而通過結(jié)合植物防御相關(guān)基因啟動子的ACGTCATAGA基序來調(diào)控的表達。這些展現(xiàn)了ARRs類轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控作用以及Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)RRs類轉(zhuǎn)錄因子功能的重要影響。在本研究中，‘LGR’與‘MR-1’的（）共有5處SNP差異，其中僅有無義突變在蛋白功能結(jié)構(gòu)域中發(fā)生，造成‘LGR’中MELO3C003375（CmAPRR2）的Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域大部分缺失。類似地，OREN等[8]在甜瓜‘Tam Dew’中也發(fā)現(xiàn)了相同的無義突變，并且通過等位性測驗證實了該變異是造成‘Tam Dew’幼果淺色的原因。基于Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能特點，猜測該無義突變會導致MELO3C003375（CmAPRR2）蛋白無法識別和結(jié)合下游基因，進而無法調(diào)控色素代謝，以致產(chǎn)生淺綠色果皮。對于APRR2或者ARRs類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控色素相關(guān)基因的方式（直接或者有其他基因介導），暫時未有相關(guān)深入的研究。鑒于擬南芥中轉(zhuǎn)座酶類的轉(zhuǎn)錄因子FHY3和FAR1，以及ABRE類轉(zhuǎn)錄因子ABF2、ABF3和ABF4常通過直接調(diào)節(jié)葉綠素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來影響葉綠素水平[31-32]，推測（）通過直接調(diào)控色素代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因來影響幼果果皮顏色，而缺失了Myb-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MELO3C003375（CmAPRR2）則極有可能因為無法直接識別與結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的啟動子，進而無法調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達，造成‘LGR’無法積累色素，產(chǎn)生淺綠色幼果。

作為對消費者有吸引力的性狀，果皮顏色一直是甜瓜育種的重要目標。相較于成熟果，幼嫩果實顏色相對單一，主要由葉綠素影響。但成熟果與幼嫩果實之間是否存在關(guān)聯(lián)性，研究卻很少涉及。本研究中，兩親本幼嫩果果皮顏色差異明顯，定位群體（BC1F1）單株表型也分離顯著，隨著發(fā)育進程，親本以及單株果皮顏色發(fā)生變化，但有趣的是，淺綠皮植株和深綠皮成熟果果皮顏色的綠色強度卻形成了顯著的差異分化，這表明即使果實在發(fā)育過程中會發(fā)生轉(zhuǎn)變，但成熟果果皮顏色仍然與幼嫩果果皮顏色存在緊密的相關(guān)性，該結(jié)論為未來進行甜瓜外觀品質(zhì)育種提供了思路。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在BC1F1群體幼果為深綠皮的植株中，部分單株的成熟果會表現(xiàn)出黃色，而部分單株仍然表現(xiàn)為深綠色。這表明雖然成熟果顏色與幼果顏色有顯著相關(guān)性，但兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系以及它們與果實發(fā)育進程之間的關(guān)系還需進一步的探索和解析。這為后續(xù)進行成熟果的相關(guān)研究提供了思路，也暗示選擇合適時期的材料對果實皮色的研究十分重要。

4 結(jié)論

甜瓜幼果果皮顏色（深綠和淺綠）是受單個核基因控制的質(zhì)量性狀，且深綠對淺綠為顯性。通過遺傳定位將該定位于4號染色體分子標記4-102和4-81之間，物理距離約為17.7 kb。此區(qū)間內(nèi)（）的第8個外顯子在‘LGR’中發(fā)生單堿基替換（G856T），造成蛋白翻譯提前終止，推測（）即為調(diào)控甜瓜幼果果皮顏色的基因。

[1] TADMOR Y, BURGER J, YAAKOV I, FEDER A, LIBHABER S E, PORTNOY V, MEIR A, TZURI G, SA’AR U, ROGACHEV I, AHARONI A, ABELIOVICH H, SCHAFFER A A, LEWINSOHN E, KATZIR N. Genetics of flavonoid, carotenoid, and chlorophyll pigments in melon fruit rinds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(19): 10722-10728.

[2] GUSMINI G, WEHNER T C. Genes determining rind pattern inheritance in watermelon: A review. HortScience, 2005, 40(6): 1928-1930.

[3] WHITAKER T W, DAVIS G N. Cucurbits: Botany, cultivation and utilization. Journal of Association of Official Agricultural Chemists, 1962, 45(4): 1052.

[4] PARTHASARATHY V A, SAMBANDAM C N. Inheritance in Indian melons. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 1981, 41(1): 114-117.

[5] KUBICKI B. Inheritance of some characters in muskmelons. Genetiea Polonlca, 1962, 3: 265-274.

[6] PEREIRA L, RUGGIERI V, PéREZ S, ALEXIOU K G, FERNáNDEZ M, JAHRMANN T, PUJOL M, GARCIA-MAS J. QTL mapping of melon fruit quality traits using a high-density GBS-based genetic map. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 324.

[7] BURGER Y, BHASTEKER D, SA’AR U, KATZIR N, PARIS H S. A recessive gene for light immature exterior color of melon. Cucurbit Genetics Cooperative Report, 2006, 28/29: 17-18.

[8] OREN E, TZURI G, VEXLER L, DAFNA A, MEIR A, FAIGENBOIM A, KENIGSWALD M, PORTNOY V, SCHAFFER A A, LEVI A, BUCKLER E S, KATZIR N, BURGER J, TADMOR Y, GUR A. The multi-allelic APRR2 gene is associated with fruit pigment accumulation in melon and watermelon. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(15): 3781-3794.

[9] HUGHES M. The inheritance of two characters ofand their interrelationship. Journal of the American Aociety for Horticultural Science, 1948, 52: 399-402.

[10] FEDER A, BURGER J, GAO S, LEWINSOHN E, KATZIR N, SCHAFFER A A, MEIR A, DAVIDOVICH-RIKANATI R, PORTNOY V, GAL-ON A, FEI Z J, KASHI Y, TADMOR Y. A kelch domain- containing F-box coding gene negatively regulates flavonoid accumulation in muskmelon. Plant Physiology, 2015, 169(3): 1714-1726.

[11] EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J, OBANDO J, FERNANDEZ-TRUJILLO J P, MARTINEZ J A, ALARCóN A L, ALVAREZ J M, VAN DER KNAAP E. Estimating the genetic architecture of fruit quality traits in melon (L.) using a genomic library of near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2007, 132(1): 80-89.

[12] OBANDO J, FERNáNDEZ-TRUJILLO J P, MARTíNEZ J A, ALARCóN A L, EDUARDO I, ARúS P, MONFORTE A J. Identification of melon fruit quality quantitative trait loci using near-isogenic lines. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2008, 133(1): 139-151.

[13] PITRAT M, HANELT P, HAMMER K. Some comments on infraspecific classification of cultivars of melon. Acta Horticulturae, 2000, 510: 29-36.

[14] 林德佩. 中國栽培甜瓜植物的起源、分類及進化. 中國瓜菜, 2010(4): 34-36.

LIN D P. Origin classification and evolution for cultivated plants of Chinese melon. China Cucurbits and Vegetables, 2010(4): 34-36. (in Chinese)

[15] LIU H Q, JIAO J Q, LIANG X J, LIU J, MENG H W, CHEN S X, LI Y H, CHENG Z H. Map-based cloning, identification and characterization of the w gene controlling white immature fruit color in cucumber (L.). Theoretical and Applied Genetics, 2016, 129(7): 1247-1256.

[16] PAN Y, BRADLEY G, PYKE K, BALL G, LU C G, FRAY R, MARSHALL A, JAYASUTA S, BAXTER C, VAN WIJK R, BOYDEN L, CADE R, CHAPMAN N H, FRASER P D, HODGMAN C, SEYMOUR G B. Network inference analysis identifies an APRR2-like gene linked to pigment accumulation in tomato and pepper fruits. Plant Physiology, 2013, 161(3): 1476-1485.

[17] 賈繼增, 高麗鋒, 趙光耀, 周文斌, 張衛(wèi)健. 作物基因組學與作物科學革命. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2015, 48(17): 3316-3332.

JIA J Z, GAO L F, ZHAO G Y, ZHOU W B, ZHANG W J. Crop genomics and crop science revolutions. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(17): 3316-3332. (in Chinese)

[18] ZHAO G W, LIAN Q, ZHANG Z H, FU Q S, HE Y H, MA S W, RUGGIERI V, MONFORTE A J, WANG P Y, JULCA I, WANG H S, LIU J P, XU Y, WANG R Z, JI J B, XU Z H, KONG W H, ZHONG Y, SHANG J L, PEREIRA L, ARGYRIS J, ZHANG J A, MAYOBRE C, PUJOL M, OREN E, OU D D, WANG J M, SUN D X, ZHAO S J, ZHU Y C, LI N, KATZIR N, GUR A, DOGIMONT C, SCHAEFER H, FAN W, BENDAHMANE A, FEI Z J, PITRAT M, GABALDóN T, LIN T, GARCIA-MAS J, XU Y Y, HUANG S W. A comprehensive genome variation map of melon identifies multiple domestication events and loci influencing agronomic traits. Nature Genetics, 2019, 51(11): 1607-1615.

[19] 楊光華, 范榮, 楊小鋒, 侯軍亮, 袁士臣, 曹明, 王學林, 李勁松. 甜瓜果實顏色3個質(zhì)量性狀基因的定位. 園藝學報, 2014, 41(5): 898-906.

YANG G H, FAN R, YANG X F, HOU J L, YUAN S C, CAO M, WANG X L, LI J S. Construction of a highly dense genetic map using SNP and mapping of three qualitative traits in. Acta Horticulturae Sinica, 2014, 41(5): 898-906. (in Chinese)

[20] 歐點點, 趙光偉, 賀玉花, 王平勇, 徐志紅, 孔維虎, 張健, 徐永陽. 甜瓜果皮顏色遺傳分析及基因定位. 中國農(nóng)學通報, 2019, 35(13): 64-69.

OU D D, ZHAO G W, HE Y H, WANG P Y, XU Z H, KONG W H, ZHANG J A, XU Y Y. Genetic analysis and gene mapping for melon rind color. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2019, 35(13): 64-69. (in Chinese)

[21] FALLIK E, ALKALI-TUVIA S, HOREV B, COPEL A, RODOV V, AHARONI Y, ULRICH D, SCHULZ H. Characterization of ‘Galia’ melon aroma by GC and mass spectrometric sensor measurements after prolonged storage. Postharvest Biology and Technology, 2001, 22(1): 85-91.

[22] REID M S, LEE T H, PRATT H K, CHICHESTER C O. Chlorophyll and carotenoid changes in developing muskmelons. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1970, 95(6): 814-815.

[23] FLüGEL M, GROSS J. Pigment and plastid changes in mesocarp and exocarp of ripening muskmeloncv. Galia. Angewandte Botanik, 1982, 56(5/6): 393-406.

[24] LIGHTBOURN G J, GRIESBACH R J, NOVOTNY J A, CLEVIDENCE B A, RAO D D, STOMMEL J R. Effects of anthocyanin and carotenoid combinations on foliage and immature fruit color ofL. Journal of Heredity, 2008, 99(2): 105-111.

[25] CHEN M, JI M L, WEN B B, LIU L, LI S X, CHEN X D, GAO D S, LI L. GOLDEN 2-LIKE transcription factors of plants. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1509.

[26] WATERS M T, MOYLAN E C, LANGDALE J A. GLK transcription factors regulate chloroplast development in a cell-autonomous manner. The Plant Journal, 2008, 56(3): 432-444.

[27] WATERS M T, WANG P, KORKARIC M, CAPPER R G, SAUNDERS N J, LANGDALE J A. GLK transcription factors coordinate expression of the photosynthetic apparatus in. The Plant Cell, 2009, 21(4): 1109-1128.

[28] MASON M G, MATHEWS D E, ARGYROS D A, MAXWELL B B, KIEBER J J, ALONSO J M, ECKER J R, SCHALLER G E. Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in. The Plant Cell, 2005, 17(11): 3007-3018.

[29] ARGYROS R D, MATHEWS D E, CHIANG Y H, PALMER C M, THIBAULT D M, ETHERIDGE N, ARGYROS D A, MASON M G, KIEBER J J, SCHALLER G E. Type B response regulators ofplay key roles in cytokinin signaling and plant development. The Plant Cell, 2008, 20(8): 2102-2116.

[30] CHOI J, HUH S U, KOJIMA M, SAKAKIBARA H, PAEK K H, HWANG I. The cytokinin-activated transcription factor ARR2 promotes plant immunity via TGA3/NPR1-dependent salicylic acid signaling in. Developmental Cell, 2010, 19: 284-295.

[31] TANG W J, WANG W Q, CHEN D Q, JI Q A, JING Y J, WANG H Y, LIN R C. Transposase-derived proteins FHY3/FAR1 interact with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1 to regulate chlorophyll biosynthesis by modulating HEMB1 during deetiolation in. The Plant Cell, 2012, 24(5): 1984-2000.

[32] GAO S, GAO J, ZHU X Y, SONG Y, LI Z P, REN G D, ZHOU X, KUAI B K. ABF2, ABF3, and ABF4promote ABA-mediated chlorophyll degradation and leaf senescence by transcriptional activation of chlorophyll catabolic genes and senescence-associated genes in. Molecular Plant, 2016, 9(9): 1272-1285.

Fine Mapping of an Immature Rind Color Genein Melon

XU XinYang, SHEN Jia, ZHANG YueJian, LI GuoJing, NIU XiaoWei, SHOU WeiSong

Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021

【】The aim of this study was to explore the inheritance pattern of immature rind color of melon(L.), to fine map target gene, and to deepen the understanding of rind color change during fruit growth, so as to provide a guidance for the improvement of melon color with molecular design breeding.【】The dark-green rind line ‘MR-1’ (.ssp.) and the light-green rind line ‘LGR’ (C.ssp.) were used as parents to construct the F1hybrid population, and the BC1F1backcross population was constructed from crossing by F1and ‘LGR’ for genetic analysis of immature rind color. By selecting 20 dark-green and light-green plants each in BC1F1population, the DNA was mixed, respectively, and the BSA-seq was operated for initial mapping. Based on the resequencing of two parents, the molecular markers with better specificity were developed in the initial region and recombinant individuals were identified and selected to verify and narrow the interval for fine mapping thegene. By sequencing of coding regions between two parents according to the gene annotation, the candidate gene and key variant site were determined. Moreover, the phenotype of immature and mature fruit in the BC1F1backcross population was investigated and assessed by correlation analysis to explore the underlying mechanism of rind color transition in the fruit development.【】According to the investigation, the phenotype of all F1individual plants exhibited dark-green rind color. In addition, the immature rind color of BC1F1 backcross population was found to be separated, and the ratio of the number of dark-green to light-green was approximately 1﹕1. As well as, the ratio of the number of dark-green to light-green in the F2population was 3﹕1. These ratios corresponded to Mendel’s law of inheritance, indicating that the immature rind color of melon was a quality trait, controlled by a single nuclear gene, and the dark-green was dominant to light-green. Through BSA-seq, the gene was initially mapped to a 1.8 Mb interval on the long arm of chromosome 4. With developed molecular markers, 24 recombinant individuals were selected in expanded mapping population. The gene was further narrowed down to a region between markers 4-102 and 4-81 with a physical distance of 17.7 kb by genotype and phenotype verification of offspring, where were four predicted genes with latest annotation. Sequencing analysis revealed that a geneencoding GLKs transcription factor CmAPRR2 had several variations in ‘MR-1’ and ‘LGR’. Among them, there were three synonymous, a missense mutation, and a nonsense mutation. The nonsense mutation (G to T) appeared in the 856th base of the coding region led to premature translation termination and most of the Myb-DNA binding domain to be lost in ‘LGR’. Thus, the() was speculated to be thegene and the nonsense mutation was the key variation that affected the immature rind color of melon. It was found that there was a significant correlation between the rind color of immature fruit and mature fruit by investigating the phenotype of fruits in the BC1F1backcross population.【】Immature rind color (dark green/light green) of melon was a quality trait and controlled by a single nuclear gene. By mapping,() was presumed to be the candidate gene that affected immature rind color.

melon; immature rind color; gene mapping;;()

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.014

2020-09-20；

2020-12-16

浙江省第三次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動（111821301354052030）、浙江省農(nóng)業(yè)（蔬菜）新品種選育重大科技專項（2016C02051-4-4）

許昕陽，E-mail：shine2014201048@163.com。通信作者壽偉松，E-mail：shouws@zaas.ac.cn

（責任編輯 趙伶俐）