大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定及基于HIGS技術的功能分析

張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定及基于HIGS技術的功能分析

張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

石河子大學農學院，新疆石河子 832003

【】從大麗輪枝菌（）中鑒定木糖苷酶基因，研究其與大麗輪枝菌致病力的關系，為解析大麗輪枝菌致病分子機制提供理論依據，同時為制定更好的棉花黃萎病防治策略提供科學依據。利用生物信息學方法從大麗輪枝菌基因組數據庫中鑒定全部木糖苷酶基因，并對基因編碼蛋白的結構域、基因的染色體定位及進化關系等進行分析。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品種根系分泌物培養0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌中的表達量。利用寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術對木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過程中的功能進行初步分析。將的目標片段轉化棉花，采用傷根法接種大麗輪枝菌Vd991，觀察轉化植株的表型，調查病情指數，同時利用qRT-PCR技術對植株中真菌生物量和的表達量進行檢測。利用生物信息學方法從大麗輪枝菌中查找出13個木糖苷酶基因（—），其編碼序列長度介于1 461—2 544 bp，蛋白質分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點介于4.67—5.89。結構域和進化樹分析發現13個木糖苷酶基因中包括9個糖苷水解酶43家族成員、1個3家族成員和3個31家族成員。染色體定位分析發現13個基因分布在6條染色體上，未形成基因簇。qRT-PCR結果發現選取的6個基因均受到根系分泌物的誘導，在一種或多種根系分泌物中培養6 h或12 h后，表達量均明顯升高，然后降低。其中受海島棉根系分泌物誘導后表達量明顯升高，表明該基因的表達明顯受海島棉根系分泌物的誘導。HIGS研究結果表明，接菌14 d和21 d后轉化基因干擾片段的棉花發病明顯較重，其病情指數（33.3和83.9）明顯高于空載體對照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析發現轉化基因干擾片段的棉花植株莖中的表達量明顯低于空載體對照，真菌生物量顯著多于對照。利用HIGS技術將基因沉默后，棉株的抗病性明顯降低，表明在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發揮著重要的作用。

棉花；大麗輪枝菌；黃萎病；；木糖苷酶；寄主誘導的基因沉默

0 引言

【研究意義】我國是世界上主要的棉花生產和消費國，新疆是最大的植棉省區，已連續25年保持單產、總產和調出量全國第一。2019年新疆棉花播種面積254.05萬公頃，皮棉產量500.2萬噸，分別占全國的76.1%和84.9%，棉花產業已成為新疆的重要經濟支柱和農民收入的主要來源。棉花黃萎病是一種土傳性維管束真菌病害[1]，嚴重影響棉花的產量和纖維品質[2]。我國棉區的黃萎病主要是由大麗輪枝菌（）引起[3]。大麗輪枝菌入侵寄主后，其菌絲體大量生長阻礙植物木質部對營養物質的運輸[4]，同時產生水解酶和毒素等物質作用于寄主，最終導致植株死亡[1,5]。由于大麗輪枝菌具有穩定存在的微菌核結構以及多變的生理型，棉花黃萎病至今難以防治。挖掘大麗輪枝菌致病相關基因并進行功能驗證，對揭示大麗輪枝菌的致病分子機制以及制定更好的棉花黃萎病防治策略具有重要意義。【前人研究進展】近年來，隨著大麗輪枝菌全基因組測序的完成和生物信息學工具的發展，其致病相關基因的挖掘及功能研究已取得較大進展[6-10]，但由于大麗輪枝菌致病機制非常復雜，其研究仍處于探索階段。大麗輪枝菌入侵過程中會產生胞外分泌蛋白，其中含有大量的植物細胞壁降解酶，能夠降解寄主植物的細胞壁多糖以達到入侵和定殖的目的[1,5,11]。植物細胞壁的橫向結構主要由半纖維素和木質素結合而成。木聚糖是半纖維素的主要成分，最高可占細胞干重的35%，是植物中第二豐富的生物聚合物，僅次于纖維素。木聚糖的降解在大麗輪枝菌的致病過程中發揮重要作用[12]。木聚糖酶和木糖苷酶是降解木聚糖的關鍵酶，前者將木聚糖降解成小片段，后者則利用外切的性質將小片段水解釋放木糖[13-14]。已有多種病原菌分泌的木聚糖酶被發現與其致病力密切相關[15-16]，然而木糖苷酶與致病力的關系尚不清楚。依據木糖苷酶水解的糖苷鍵不同，可分為-木糖苷酶和-木糖苷酶兩種類型。依據氨基酸序列相似性，在Carbohydrate Active Enzymes數據庫（CAZy，http://www.cazy.org/）中-木糖苷酶被劃分為GH31家族，-木糖苷酶被歸類于糖苷水解酶GH3、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54和GH120家族。-木糖苷酶的相關報道較多，目前狹義的木糖苷酶一般指的是-木糖苷酶。-木糖苷酶在自然界中廣泛存在，在高等植物和微生物中均已得到分離，在能源工業、造紙工業和醫藥行業中已得到廣泛應用[17-18]。【本研究切入點】真菌中已有多個木糖苷酶基因被克隆[19-20]，大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定及功能研究尚未見報道。實驗室前期通過對不同抗性棉花品種的根系分泌物培養大麗輪枝菌的轉錄組分析，發現一個木糖苷酶基因（VDAG_01866）能夠響應感病棉花品種的根系分泌物，暗示其在大麗輪枝菌早期寄主識別和侵染過程中發揮著重要作用[21]。【擬解決的關鍵問題】對大麗輪枝菌木糖苷酶基因進行全基因組鑒定和生物信息學分析，并利用qRT-PCR技術檢測木糖苷酶基因在3種根系分泌物培養不同時間大麗輪枝菌中的表達量。利用寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術對在棉花致病過程中的功能進行分析，探討木糖苷酶基因與大麗輪枝菌致病力的關系。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在石河子大學完成。

1.1 供試材料及處理

供試材料為陸地棉（）新陸早8號（感病品種）、中植棉2號（耐病品種）和海島棉（）海7124（抗病品種），均由石河子大學棉花研究所提供。大麗輪枝菌強致病菌株Vd991由石河子大學綠洲生態農業重點實驗室保存。

1.1.1 棉苗的種植 將棉種在溫水中浸泡8—12 h后，在28℃恒溫培養箱中催芽，挑選發芽整齊一致的種子均勻種植在霍格蘭營養液中，每盆種植18棵棉苗，每3 d添加一次霍格蘭營養液使總體積保持5 L，培養30 d后收集根系分泌物。先用濾紙對每盆中液體進行過濾，再用細菌過濾器（直徑0.22 μm）進行過濾，然后在冷凍干燥機中將過濾后的溶液濃縮至1 L，放置在4℃冰箱備用。另外，挑選發芽整齊一致的種子均勻種在等體積混合的營養土與蛭石中，培養溫度26℃，相對濕度80%，光周期16 h光照/8 h黑暗，待植株長出2片真葉后用于農桿菌的注射和大麗輪枝菌的脅迫處理。

1.1.2 大麗輪枝菌樣本的制備 挑取PDA培養基上生長10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養基中，26℃、150 r/min振蕩培養5—7 d，分裝入50 mL離心管中，12 000 r/min收集Vd991菌體。每份稱取0.5 g菌體，分別加入10 mL根系分泌物，培養0、6、12、24和48 h后收集菌體，設置3次生物學重復，共收集45份菌體。

1.2 方法

1.2.1木糖苷酶基因的鑒定及亞細胞定位預測 從大麗輪枝菌數據（https://fungi.ensembl.org/ Verticillium_ dahliae/Search/ Results?Species=Verticillium%20dahliae; idx=;q=arabinosidase;site=ensemblthis）網站下載Verticillium_dahliae. ASM15067v2. GFF3、CDS、genomic和protein序列文件，利用TBtools軟件對GFF3文件中所有木糖苷酶基因進行搜索，初步獲得大麗輪枝菌木糖苷酶基因，同時在CDS、蛋白質、全基因組序列文件中獲取基因對應的cDNA序列、蛋白質序列以及基因組序列。利用SMART在線軟件（http://smart.Emblh eidelberg.de/）進一步分析基因是否具有糖苷水解酶家族的主結構域，去除不完整的短片段和重復的序列，最終確定大麗輪枝菌中全部木糖苷酶基因。利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的蛋白質殘基數（aa）、分子量（kD）和等電點（pI）。利用在線軟件ProtComp9.0（http://www.softberry.com/ berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup =proloc）對蛋白質的亞細胞定位進行預測。

1.2.2 木糖苷酶基因的生物信息學分析 利用SMART在線軟件預測木糖苷酶基因蛋白信號肽和結構域，利用DOG2.0軟件繪制蛋白的結構域圖。以13個木糖苷酶基因蛋白序列的主結構域為探針序列，利用NCBI Blast P（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對，從搜索結果中選擇E值小、Score值大的來自其他物種的木糖苷酶基因序列。利用MEGA6.0提供的ClustalW程序對大麗輪枝菌及其他物種中的木糖苷酶基因蛋白序列進行多重序列比對，然后通過臨位相連法構建系統進化樹。從大麗輪枝菌數據庫下載木糖苷酶基因的CDS、基因組序列，利用在線軟件Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）分析木糖苷酶基因外顯子-內含子的數目及分布。從大麗輪枝菌全基因組數據庫中獲得木糖苷酶基因染色體分布以及長度信息，利用Map Inspect繪制木糖苷酶基因染色體定位圖。

1.2.3 大麗輪枝菌總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用Fungal RNA Kit（OMEGA）提取大麗輪枝菌樣本總RNA，用DNase Ⅰ消解DNA后，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用NanoDrop 2000 DNA濃度測定儀測定RNA的濃度和OD260nm/ OD280 nm值。用MMLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.4 木糖苷酶基因的表達分析 依據進化樹分類結果及實驗室前期轉錄組數據[21]，從GH3、GH31和GH43 3個糖苷水解酶家族中挑選6個基因（、、、、和），其中來自GH3家族，和來自GH43家族，、和來自GH31家族。設計這6個木糖苷酶基因的特異性引物（表1），以培養0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌的cDNA為模板，利用qRT-PCR對基因的表達模式進行分析，大麗輪枝菌微管蛋白基因作為內參基因。qRT-PCR反應在美國羅氏 LightCycler? 480系統上進行，反應參數：94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循環，所有反應設置3次重復，按照 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

劃線部分為酶切位點The underlined part is the restriction site.R I: GAATTC;I: GGTACC

1.2.5 基于HIGS技術的基因沉默 木糖苷酶基因干擾片段的克隆：根據NCBI網站Primer3-Blast在線設計的特異引物-F/R，在上下游引物中分別引入R I和I酶切位點（表1），以大麗輪枝菌cDNA為模板擴增的干擾片段。PCR反應體系（20 μL）：ddH2O 13.2 μL，10×Ex Taq Buffer 2 μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，cDNA模板1 μL；上游引物-F1（10 μmol·L-1）1 μL，下游引物-R1（10 μmol·L-1）1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL。擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，29次循環；72℃ 10 min。PCR產物經電泳檢測回收后，連接至pMD19-T simple載體轉化DH5感受態細胞，挑取陽性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測序，獲得T-重組質粒。

HIGS載體的構建：提取pTRV2空載體質粒和T-重組質粒，分別用R I和I進行雙酶切，回收pTRV2載體線性化片段和干擾片段，采用T4DNA連接酶連接回收的兩個片段，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單菌落搖培后提取質粒，利用PCR和雙酶切對重組質粒pTRV2-進行鑒定。

棉花的注射及侵染：用電擊轉化法將pTRV1、pTRV2-、空載體pTRV2-和對照載體pTRV2-（該基因突變使葉片失綠）分別轉化農桿菌GV3101。待棉苗兩片子葉平展時，挑取含pTRV1、pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的農桿菌單菌落加入30 mL LB液體培養基（卡那霉素50 mg·L-1，利福平25 mg·L-1）中，28℃、200 r/min過夜培養。將搖培的菌液放入4℃離心機5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入孢子懸浮液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）和200 pmol·L-1AS（乙酰丁香酮），重懸后將菌液的濃度調至OD600=0.8。將準備好的含pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別與含pTRV1的重懸液按照1﹕1的比例混合，室溫靜置3 h后注射棉花。用1 mL無針頭注射器采用壓迫法注射生長10 d的棉苗，將菌液注入展平的子葉中，使菌液充滿整個子葉。含pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別注射80棵棉苗，將注射后的棉花放置于22—25℃條件下暗培養12 h，然后恢復至正常光照培養。

1.2.6 抗病性鑒定 大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備：挑取PDA培養基上生長10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養基中，26℃、150 r/min振蕩培養5—7 d，用滅菌的紗布過濾菌液后獲得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數板計數，將孢子懸浮液調至1.0×107cfu/mL。

病情指數調查：注射農桿菌菌液后7—10 d，待pTRV2-處理的棉苗真葉完全呈現黃白色時，制備濃度為1×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花感病品種新陸早8號，每株接種20 mL孢子懸浮液。選取20株pTRV2-處理過的棉苗作為水處理對照（Mock）。侵染15—30 d后，對新陸早8號的感病情況進行統計[22]。

真菌生物量檢測：接Vd991后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA（CTAB法），利用棉花內參基因（DQ116441.1）和黃萎病特異引物ITS1-F和ST-Ve1- R[23]進行qRT-PCR，測定其中大麗輪枝菌的生物量。

目標基因表達量檢測：采用EASYspinPlus植物RNA提取試劑盒（Aidlab，北京，中國）提取接菌后14 d棉株莖的總RNA，反轉錄為cDNA，以為內參基因，-F和-R為引物，利用qRT-PCR對的表達量進行分析。

大麗輪枝菌恢復培養：接菌后14 d，隨機選取pTRV2-和pTRV2處理棉苗各10株，用于大麗輪枝菌的恢復試驗。從暴露于蛭石表面的莖基部切斷植株，向上每隔2 cm取一個莖段，每個植株取3段。將莖段放入75%酒精浸泡30 s，然后在0.1%的升汞溶液中浸泡消毒5 min，無菌水沖洗3—5次，將處理的莖段均勻擺放在PDA平板上，25℃培養7—10 d。待大麗輪枝菌菌落長出后，觀察菌落的生長情況。

2 結果

2.1 大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定

通過大麗輪枝菌基因組數據庫的搜索結合在線工具SMART結構域分析，共鑒定出13個木糖苷酶基因，定名為—（表2）。這些木糖苷酶基因的編碼序列（coding sequence，CDS）長度為1 461— 2 544 bp，編碼的氨基酸為335—834個，蛋白質分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點介于4.67—5.89。亞細胞定位預測發現這些基因大多是細胞膜外的蛋白質，部分定位于細胞質、膜結合的溶酶體、細胞核或膜結合高爾基體上。13個基因中包含4個木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶基因（），1個-葡糖苷酶/-木糖苷酶（），5個-木糖苷酶基因（）和3個-木糖苷酶基因（）。

2.2 大麗輪枝菌木糖苷酶基因編碼蛋白的結構域分析

利用SMART在線工具（http://smart.embl-heidelberg. de/smart/batch.pl）對13個木糖苷酶基因編碼蛋白進行了信號肽和結構域預測，分析發現VdxyL6含有糖苷水解酶Glyco_hydro_3（紅色）和Glyco_hydro_3_C結構域（黃色）；VdxyL4、VdxyL8和VdxyL12均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_31結構域（綠色）；其中VdxyL8還含有Gal_mutarotas_2結構域（橙色）；VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_43結構域（藍色）；其中VdxyL3含有兩個Glyco_hydro_43結構域。13個基因編碼的蛋白中VdxyL3、VdxyL6、VdxyL7、VdxyL9和VdxyL11含有不同長度的信號肽（黑色）（圖1）。

表2 大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定

黑色表示信號肽；藍色表示Glyco_hydro 43結構域；綠色表示Glyco_hydro 31結構域；紅色表示Glyco_hydro 3結構域；黃色表示Glyco_hydro 3_C結構域；橙色表示Gal_mutarotas_2結構域Black indicates the signal peptide; Blue indicates the Glyco_hydro 43 domain; Green indicates the Glyco_hydro 31 domain; Red indicates the Glyco_hydro 3 domain; Yellow indicates the Glyco_hydro 3_C domain; Orange indicates the Gal_mutarotas_2 domain

2.3 木糖苷酶基因多重序列比對及進化樹的構建

通過在線軟件NCBI中多序列比對查找并選取其他物種中12個木糖苷酶基因編碼的蛋白序列，其中XP 018236340.1（尖鐮孢）、RMZ44074.1（黃曲霉）、TFL04453.1（細翼蕨）、TDZ59664.1（三葉炭疽菌）、TEA21443.1（紫蘇炭疽菌）和THX71209.1（出芽短梗霉菌）屬于糖苷水解酶43家族；CVK94262.1（芒果鐮孢）和CVL11996.1（層出鐮孢）屬于糖苷水解酶3家族；RKK75644.1（尖鐮孢）、KPM38392.1（新蜜環菌）、XP 003721488.1（稻瘟病菌）和XP 028469785.1（堿性鈉酵母菌）屬于糖苷水解酶31家族；將12個木糖苷酶基因與大麗輪枝菌13個木糖苷酶基因編碼的蛋白進行系統進化樹分析（圖2），25個蛋白被清晰地分成3組。VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13與其他物種中43家族成員聚為一類；VdxyL6與其他物種中3家族成員聚為一類；VdxyL4、VdxyL12、VdxyL8與其他物種中31家族成員聚為一類；該結果與結構域預測結果一致，表明大麗輪枝菌13個木糖苷酶基因中，包括9個糖苷水解酶43家族成員，1個糖苷水解酶3家族成員和3個31家族成員。

紅色表示Glyco_hydro 3家族；紫色表示Glyco_hydro 31家族；藍色表示Glyco_hydro 43家族

2.4 木糖苷酶基因結構分析

利用在線軟件GSDS對13個木糖苷酶基因結構進行分析，結果如圖3所示和含有5個外顯子和4個內含子；含有4個外顯子和3個內含子；、和含有3個外顯子和2個內含子；、、、和含有2個外顯子和1個內含子；和含有1個外顯子，無內含子。

2.5 大麗輪枝菌木糖苷酶基因染色體分布

大麗輪枝菌共有8條染色體，13個木糖苷酶基因分布在6條染色體上。Chr02、Chr03和Chr07上分別含有3個木糖苷酶基因，Chr02上分布的基因為、和，Chr03上分布的基因為、和，Chr07上分布的基因為、和。Chr04上分布2個基因和。Chr01和Chr08上各含有一個木糖苷酶基因，分別為和（圖4）。根據200 kb核苷酸中含3個以上基因為1個基因簇的定義，木糖苷酶基因沒有形成基因簇。

圖3 大麗輪枝菌木糖苷酶基因結構分析

圖4 大麗輪枝菌木糖苷酶基因在染色體上的分布

2.6 木糖苷酶基因在根系分泌物誘導下的表達分析

qRT-PCR結果發現6個基因均受到根系分泌物的誘導，在一種或多種根系分泌物中培養6 h或12 h后，表達量均明顯升高，然后降低。在海7124根系分泌物誘導6 h的表達量明顯高于其他樣本，表明該基因的表達明顯受海島棉根系分泌物的誘導。、、、和在耐病品種（中植棉2號）根系分泌物誘導6 h樣本中的表達量明顯高于其他樣本，其中的表達僅受到耐病品種根系分泌物的誘導，的表達也受感病陸地棉品種（新陸早8號）根系分泌物的誘導，、和受3種不同抗/感品種根系分泌物的誘導（圖5）。該研究結果表明大麗輪枝菌木糖苷酶基因在響應棉花根系分泌物的過程中可能發揮著重要作用。根據qRT-PCR結果結合實驗室前期轉錄組數據，選取用于進一步的功能研究。

圖5 木糖苷酶基因在不同棉花品種根系分泌物培養的大麗輪枝菌中表達模式

2.7 HIGS沉默效果檢測

選取進行HIGS沉默研究。將注射pTRV2-的棉花作為陰性對照，注射pTRV2-的棉花為陽性對照。注射10 d后，pTRV2-處理植株真葉出現黃化現象（圖6-A），表明HIGS體系可以成功抑制目標基因表達。制備濃度為1.0× 107cfu/mL大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花。接菌14 d后，采集pTRV2-和pTRV2-處理的棉花莖，提取RNA并反轉錄為cDNA，以-F/R為引物，利用qRT-PCR分析的表達水平，結果發現pTRV2-處理的棉花莖中的表達量明顯低于pTRV2-（圖6-B），表明pTRV2-處理棉株中大麗輪枝菌的表達成功受到抑制。

A：注射pTRV2-GhCHLI 10 d后感病品種新陸早8號的表型Phenotypes ofsusceptible variety Xinluzao 8 after 10 days of injection with pTRV2-GhCHLI；B：qRT-PCR 檢測VdxyL3在pTRV2-00 和pTRV2-VdxyL3處理植株中的表達量。從接菌14 d后植株莖稈中提取棉花總RNA。tubulin為內參基因qRT-PCR analysis of VdxyL3 expression in the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants. Total RNA was isolated from stems at 14 dpi. tubulin was used as the control

2.8 病情調查

接菌后14 d和21 d，分別對pTRV2-和pTRV2-處理植株的發病情況進行調查。接菌后14 d，pTRV2-處理植株出現輕微的葉片黃化現象，而pTRV2-處理植株呈現明顯的黃化和萎蔫現象；接菌后21 d，pTRV2-處理植株葉片出現明顯的黃化、萎蔫和脫落現象，而pTRV2-處理植株發病嚴重，葉片脫落較多（圖7-A）。兩種處理植株的正常生長均受到影響，但pTRV2-處理植株的株高略矮于pTRV2-處理植株（圖7-B）。病情指數調查發現pTRV2-處理植株在接菌14 d和21 d的病情指數（33.3和83.9）均顯著高于pTRV2-植株14 d和21 d（21.7和66.1）（圖7-C）。剖桿試驗發現pTRV2-處理植株褐化程度明顯較高（圖7-D）。

2.9 大麗輪枝菌恢復培養和真菌相對生物量檢測

接菌后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA，利用qRT-PCR檢測真菌生物量。同時，收取pTRV2-和pTRV2-處理棉苗的莖用于大麗輪枝菌的恢復試驗。大麗輪枝菌恢復培養和真菌生物量檢測發現pTRV2-處理植株莖中的真菌生物量顯著多于pTRV2-處理植株（圖8-A、8-B），表明抑制的表達增強了大麗輪枝菌的致病力。

3 討論

木糖苷酶基因對于降解植物細胞壁中的木聚糖至關重要，篩選大麗輪枝菌致病相關木糖苷酶基因，可為防治由該菌引起的植物黃萎病提供理論依據。木糖苷酶基因屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，該家族編碼的酶能夠以內切或外切的方式水解含糖化合物中的糖苷鍵。根據CAZy數據庫依據氨基酸序列相似性對于糖苷水解家族的分類，共有168個公認的家族（GH1-168）。本研究從大麗輪枝菌中鑒定了13個木糖苷酶基因，它們分別屬于GH3、GH31和GH43家族。真菌的-木糖苷酶大都屬于GH3家族糖苷水解酶[24]。與前人研究不同，本研究13個基因中大多數（、、、、、、、和）屬于GH43家族，僅有1個（）屬于GH3家族。有的-木糖苷酶是雙功能酶，具有雙重酶催化活性[25-26]，本研究中和具有-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶雙重酶活性，具有-葡糖苷酶/-木糖苷酶活性。-木糖苷酶在低聚木糖的末端還原端催化末端未經取代的木糖甙水解，13個基因中包括3個-木糖苷酶基因（、和），均屬于GH31家族成員。

A：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和21 d表型Disease symptom of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株的株高Plant height of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；C：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和 21 d病情指數統計Disease index of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；D：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d后莖稈的表型Disease symptom in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi

A：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈中病原菌相對含量測定Quantification of the relative fungal biomass in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈大麗輪枝菌恢復培養。將莖稈置于PDA培養基，25℃培養箱中培養7 d后拍照Fungal isolation in the stem sections from pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi. Stems were plated on PDA medium. Photos were taken at 7 dpi of culture at 25℃

了解宿主與病原體的相互作用對于黃萎病的防控具有重要意義。在這個病理系統中，病害循環始于大麗輪枝菌微菌核對宿主根系分泌物刺激的響應和萌發[27]。感病品種根系分泌物促進大麗輪枝菌的生長，而抗病品種根系分泌物抑制其生長[28-29]。EI-Bebany等[27]研究發現，感病馬鈴薯品種根系分泌物誘導后大麗輪枝菌中差異基因的數量多于中抗品種根系分泌物誘導后的數量，高侵染力病原菌中受感病品種根系分泌物誘導表達的基因被認為與致病相關；Zhang等[21]研究發現，感病棉花品種根系分泌物誘導后大麗輪枝菌中差異基因的數量明顯多于耐病和抗病品種根系分泌物誘導后的數量，一些編碼水解酶和跨膜轉運蛋白的基因受感病品種根系分泌物誘導后明顯上調，被認為與致病相關；Xu等[9]研究表明，受棉花根誘導后表達量明顯上調，敲除和回補試驗發現該基因在大麗輪枝菌的產孢、菌絲體的發育、微菌核的形成和致病過程中發揮著重要作用，該基因HIGS沉默棉株的抗病性明顯增強。上述研究表明棉花根系分泌物能夠影響大麗輪枝菌中基因的表達，受其誘導表達的基因在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發揮著重要的作用。本研究利用qRT-PCR對不同抗/感棉花品種根系分泌物誘導后大麗輪枝菌中6個木糖苷酶基因的表達量變化進行了分析，發現其表達均受根系分泌物的誘導，因此可將其作為研究大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作機制的候選基因。

大麗輪枝菌的致病分子機制非常復雜，近年來其致病相關基因的研究取得了階段性的進展。大麗輪枝菌致病相關基因包括效應因子和細胞壁降解酶相關基因，如[30]、[8]、[31]和[32]等；生長-致病相關基因，如[33]、[34]、[35]和[36]等。盡管認為大麗輪枝菌分泌蛋白中的細胞壁降解酶能夠參與植物細胞壁的降解，促進病原菌的定殖，但相關基因的鑒定及功能研究僅有少量報道。如果膠代謝相關基因和被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[37]。調控果膠酶和半乳糖酶活性的被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[31]。毒力因子與植物細胞壁降解有關，該基因的缺失突變體致病力降低[32]。趙玉蘭等[38]利用HIGS技術快速篩選獲得了4個細胞壁降解相關基因，轉化4個靶標基因的煙草以及混合注射的煙草病情指數均降低，抗病性增強。上述研究表明將編碼細胞壁降解酶的基因敲除或沉默導致大麗輪枝菌的致病力降低。本研究利用HIGS技術沉默后大麗輪枝菌的致病力明顯增強，導致處理棉株的病情指數明顯增高，這與前人細胞壁降解酶基因的功能研究結果不一致[31-32,37-38]，推測可能參與誘導植物體內的抗性機制，增強植株的抗性，而該基因的沉默表達導致植株抗病性減弱。鑒于大麗輪枝菌致病分子機制的復雜性，的具體作用機制有待進一步研究。

4 結論

利用生物信息學方法從大麗輪枝菌基因組數據庫中鑒定出13個木糖苷酶基因，包括9個糖苷水解酶43家族成員，1個3家族成員和3個31家族成員。6個木糖苷酶基因的表達均受到棉花根系分泌物的誘導，暗示其在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發揮著重要的作用。通過HIGS技術對木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過程中的功能進行分析，發現當被干擾后，轉化棉株的病情指數增高，抗病性減弱，表明與大麗輪枝菌的致病性相關。

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Identification of Xylosidase Genes fromand Functional Analysis Based on HIGS Technology

ZHANG XiaoXue, SUN TianGe, ZHANG YingChun, CHEN LiHua, ZHANG XinYu, LI YanJun, SUN Jie

College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang

【】The objective of this research is to identify xylosidase genes fromand study the relationship between xylosidase genes and pathogenicity of, which will provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of pathogenicity ofand a scientific basis for formulating better control strategies for verticillium wilt.【】All xylosidase genes were identified from the genome database ofby bioinformatics, and their protein domain, chromosomal location and phylogenetic relationship were analyzed. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of xylosidase genes inculturedwith different root exudates from resistant and susceptible cotton varieties for 0, 6, 12, 24 and 48 h. The function of one of the xylosidase geneswas analyzed by using host-induced gene silencing (HIGS) method. The target fragment ofwas injected into cotton, and thenVd991 was inoculated to those plants injected with target fragment ofby using root-dip approach. The phenotype of transformed plants was observed and the disease index was counted, meanwhile, the biomass of fungi and the expression level of【】Bioinformatics analysis showed that there were 13 xylosidase genes (-) in, whose coding sequences ranged from 1 461 to 2 544 bp, molecular weight of the encoded proteins ranged from 38.78 to 90.97 kD, and theoretical isoelectric point ranged from 4.67 to 5.89. Protein domain phylogenetic relationship analysis showed that there were 9 glycoside hydrolase 43 family members, 1 glycoside hydrolase 3 family member and 3 glycoside hydrolase 31 family members included in xylosidase genes. The chromosomal location analysis showed that the 13 genes were distributed on 6 chromosomes and no gene clusters were formed. qRT-PCR analysis showed that the expression of 6 xylosidase genes was induced by cotton root exudates. After being cultured in one or more root exudates for 6 h or 12 h, expression levels of these genes were significantly increased and then decreased. Among 6 genes, the expression level ofincreased significantly after sensing root exudates from sea island cotton. The results based on HIGS technology showed that after 14 and 21 days of inoculation, the disease symptom of cotton plants transformed withinterfering fragment was more serious, and the disease index (33.3 and 83.9) was significantly higher than that of empty vector control (21.7 and 66.1). qRT-PCR analysis showed that cotton plants transformed withinterfering fragment had higher fungal biomass but lower expression level ofcompared to the empty vector control.【】Thegene silencing by using HIGS technology lead to a significant decrease of cotton resistance to, indicating thatmay play a certain role in the pathogenesis ofand host-pathogen interaction.

cotton;; verticillium wilt;; xylosidase; host-induced gene silencing (HIGS)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.007

2020-11-09；

2020-12-18

國家自然科學基金（31460360）、石河子大學高層次人才科研啟動項目（RCZK202019）

張小雪，E-mail：943124507@qq.com。通信作者李艷軍，E-mail：lyj20022002@sina.com

（責任編輯 岳梅）