ATP6V1A在食管癌及食管上皮內瘤變組織中的表達及其臨床意義>

鄒陳蔚，張季，吳淼淼 ，高昳，陳海姣，劉鵬飛，沈衛東>

(1．南通大學附屬江陰醫院 消化內科，江蘇 江陰 214400； 2.徐州醫科大學江陰臨床學院 消化內科，江蘇 江陰 214400；3.南通大學附屬江陰醫院 中心實驗室，江蘇 江陰 214400)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。一般認為，食管癌是由上皮內瘤變逐步發展而來，但目前臨床上僅有少數患者可以通過體檢發現早期食管癌或食管上皮內瘤變，多數患者發現食管癌時已處于食管癌晚期。晚期食管癌的治療效果差，5年生存率相對早期食管癌明顯偏低。因此，發現一種新的分子標志物對于食管癌的早期診斷和預防具有重要意義。

空泡型質子泵(V- type proton ATPase，V- ATPase)是廣泛存在于真核細胞膜及細胞器膜的多亞基復合物，由水解ATP的外圍結構域(V1)和質子通道膜內區域(V0)組成，擁有調節細胞酸堿平衡的功能[2]。多項研究表明，V- ATPase在惡性腫瘤組織中的表達升高，對腫瘤的生長、侵襲、耐藥均可產生影響[3- 5]。ATP6V1A作為質子泵上V1結構域內的亞基，則在V- ATPase的正常運轉中發揮重要作用。本研究探討了ATP6V1A在食管癌發生及進展中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集南通大學附屬江陰醫院2012至2019年經手術、胃鏡活檢所取得的病理診斷為慢性炎、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、鱗狀細胞癌的食管病理組織共160例，并收集對應患者相關臨床資料。以病理診斷為食管慢性炎的組織作為對照(慢性炎組)，其余標本按各自病理診斷進行分組并作為實驗組。慢性炎組患者共20例，其中男13例，女7例，平均年齡(59.45±14.36)歲。低級別上皮內瘤變組患者共16例，其中男7例，女9例，平均年齡(65.31±6.56)歲。高級別上皮內瘤變組患者共21例，其中男15例，女6例，平均年齡(68.86±5.74)歲。食管癌組患者103例，其中男61例，女42例，平均年齡(65.33±6.65)歲。食管癌臨床分期根據各項輔助檢查結果，依照美國癌癥聯合會(AJCC)食管癌第八版指南綜合判定：TNM分期Ⅰ期35例，Ⅱ期27例，Ⅲ期21例，Ⅳ期20例。食管癌組癌組織直徑<3 cm共38例，≥3 cm共65例；出現淋巴結轉移的共30例，未出現淋巴結轉移的共73例。

1.2 納入及排除標準

納入標準：所有組織均經病理學檢查確診為慢性炎或低級別上皮內瘤變或高級別上皮內瘤變或食管鱗狀細胞癌；均未接受過放化療及靶向治療。排除標準：其他腫瘤轉移至食管。

1.3 主要試劑

石蠟包塊取自南通大學附屬江陰醫院病理科，免疫組化實驗使用兔單克隆抗體(EPR19270)購自艾博抗(上海)貿易有限公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 免疫組化染色

石蠟包塊制成切片，予切片脫蠟，經酒精復水、內源過氧化物酶滅活后將切片于高溫抗原修復液中修復，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，牛血清白蛋白(BSA)封閉，加入一抗(按說明書相應抗體稀釋比例操作)孵育過夜，洗片后加入兔二抗孵育1 h，再次洗片后加入DAB顯色液，顯色30 min后流水沖洗，經蘇木精復染，沖洗后封片。

1.5 觀察及處理

于光學顯微鏡下對染色后切片進行觀察，以細胞質出現棕黃或棕褐色顆粒作為陽性，使用IMAGE J軟件處理后得到量化的光密度值。

1.6 統計學處理

所有數據采用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析，計量資料應用均數±標準差表示。首先對多組數值進行方差齊性檢驗，確定方差齊性后采用單因素方差分析多組數值，并進一步使用最小顯著性差異t檢驗進行事后檢驗。使用獨立樣本t檢驗分析ATP6V1A的表達與食管癌患者各病理特征是否相關。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ATP6V1A在食管慢性炎、食管上皮內瘤變及食管癌患者組織中的表達及其異同

ATP6V1A在食管慢性炎、食管上皮內瘤變及食管癌患者組織中的表達見圖1、2。處理數據得到平均光密度值后進行方差齊性檢驗，結果顯示方差齊性(P>0.05)，使用單因素方差分析進行多組數據分析可得平均光密度值在慢性炎組、低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組、食管癌組中逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。在事后檢驗組間比較中，低級別上皮內瘤變組與慢性炎組之間差異無統計學意義(P>0.05)，余各組之間比較差異均有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表1 ATP6V1A平均光密度的比較及分析

表2 事后檢驗中對ATP6V1A平均光密度的比較與分析

圖1 ATP6V1A在食管慢性炎組織(a)、食管低級別上皮內瘤變組織(b)、食管高級別上皮內瘤變組織(c)、食管鱗狀細胞癌組織(d)中的表達 ×200

2.2 ATP6V1A與食管癌患者病理特征之間的關系

食管癌患者共計103例，使用獨立樣本t檢驗分析可得ATP6V1A的表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無明顯相關性，差異無統計學意義(P>0.05)。而TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者ATP6V1A表達高于分期為Ⅰ～Ⅱ期患者(t=3.497，P<0.05)，差異有統計學意義，伴有淋巴結轉移的患者ATP6V1A表達高于不伴有淋巴結轉移的患者(t=3.788，P<0.05)，差異有統計學意義(表3)。

表3 ATP6V1A與食管癌患者病理特征之間的關系

3 討 論

GLOBALCAN 2018的報告顯示，2018年全球因食管癌死亡人數在因各類癌癥死亡人數中排第6位[6]。食管癌具體的發生機制較為復雜，其臨床癥狀常不典型，多數患者發現時即為晚期。晚期食管癌治療的效果差，預后不佳，但食管癌的發病是由良性病變至上皮內瘤變直至癌變的動態演變過程。因此，在病變早期進行診斷及治療是降低病死率、改善預后的有效途徑。

目前的研究表明V- ATPase作為一種由ATP驅動的質子泵，與細胞內外酸堿平衡調節有關[7]，且惡性腫瘤的發生發展與V- ATPase的高表達有關[8- 9]。通過抑制V- ATPase來抑制腫瘤的生長[10- 11]也是近年來腫瘤研究領域的熱點。目前已有研究介紹了V- ATPase的多個亞基在口腔癌[12]、胃癌[13]等惡性腫瘤組織中的表達情況，但目前有關食管癌的研究較少。

A亞基可提供ATP的結合位點[2]，也有研究發現其可以維持溶酶體及溶酶體蛋白酶的功能[14]，是V- ATPase的重要組成部分。因此本研究選擇ATP6V1A作為研究對象，探究其在食管慢性炎、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、鱗狀細胞癌組織上的表達情況及其可能的臨床意義。

圖2 免疫組化染色后各組之間ATP6V1A平均光密度的比較

本研究表明，ATP6V1A從食管慢性炎、低級別上皮內瘤變到高級別上皮內瘤變、食管鱗狀細胞癌的表達逐漸升高，根據這一結果提示ATP6V1A在食管組織異型增生過程中可能起到了促進作用。進一步分組比較發現，低級別上皮內瘤變組織與慢性炎組織之間表達差異不明顯，而高級別上皮內瘤變組織及食管鱗狀細胞癌組織與其相比表達明顯升高。從而提示，ATP6V1A可以作為食管良惡性病變之間的區分標志，同時也可以作為鑒別低級別上皮內瘤變與早期食管癌較為可靠的指標。

本研究發現ATP6V1A的表達與食管癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑無關，而與臨床分期、淋巴結轉移有關。ATP6V1A的表達隨著臨床分期的增高而增加，在淋巴結轉移患者中表達顯著高于未出現淋巴結轉移患者。結果提示食管癌患者ATP6V1A的表達升高，可以作為預測食管癌進展的指標，為治療方案的選擇提供參考。

綜上所述，ATP6V1A與食管癌的進展密切相關，其可以作為一種有價值的分子標志物在食管癌的早期篩查到治療方案選擇等方面作出貢獻。而該亞基在食管癌進展中所起的具體作用，尚有待進一步分子機制方面的研究。