PD- L1、EGFR及TP53在肺腫瘤惡性轉變過程中的表達及其意義>

郭莉婷，邵偉偉，周塵飛，楊慧，石燕>

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 腫瘤科，上海 200025； 2.鹽城市第一人民醫院 病理科，江蘇 鹽城 224006)

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是最常見的肺癌亞型，平均5年生存率為15%[1- 3]。低劑量螺旋計算機斷層掃描(low- dose computed tomography, LDCT)的出現改變了肺癌篩查的前景，使用LDCT進行篩查可降低肺癌20%的死亡率[4]。隨著LDCT的廣泛使用，使得磨玻璃結節(ground- glass nodules, GGNs)的檢測率增加[5]。GGNs包括良性疾病，例如炎性疾病和局灶性纖維化，非典型腺瘤性增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)以及惡性病變，如原位腺癌(adenocarcinomainsitu, AIS)、微浸潤性腺癌(minimally invasive adenocarcinoma, MIA)以及浸潤性腺癌(invasive adenocarcinoma, IAC)。在2015年世界衛生組織(World Health Organization, WHO)分類中，AAH和AIS均被定義為浸潤性癌前病變，而MIA被確定為早期浸潤性腺癌，AAH、AIS和MIA的術后切除5年生存率接近100%，而IAC的則大幅度下降[3]。

程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, PD- L1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和TP53分子在肺腫瘤惡性轉變過程中表達的差異尚不清楚，本研究中我們通過免疫組化分析了AAH、AIS、MIA、IAC中的PD- L1、EGFR及TP53的表達，評估肺癌由腺瘤性增生向進展期肺腺癌惡性轉變過程中的分子特點，有助于了解早期肺腫瘤的發病機制，為早期針對性干預提供理論依據。肺GGNs中IAC的生存率較低，免疫治療作為一種新型的肺癌治療方法有助于改善肺癌的生存率。而PD- L1是用于免疫治療的生物標志物，因此，我們進一步探討PD- L1的表達與IAC患者臨床病理特征及預后之間的關聯，為臨床治療肺腺癌提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究設計和患者隊列

收集2015年1月至2020年12月期間在江蘇省鹽城市第一人民醫院接受肺結節根治性手術切除的患者68例，包括39例(9例AAH，10例AIS，9例MIA，11例IAC)肺腫瘤和另29例IAC。組織學亞型由兩名專門的肺癌病理學家確定。接受手術治療患者，有完整臨床資料且術前均沒有接受過放化療、免疫治療等其他相關治療。收集患者的臨床和病理特征，包括性別、年齡、分期、吸煙狀況以及患者術前的血常規(白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、血小板計數等)。該研究得到了鹽城市第一人民醫院倫理委員會的批準，所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2 儀器設備及試劑

PD- L1檢測使用丹麥Dako公司全自動免疫組化染色儀 Autostainer Link 48。兔抗人 PD- L1 單克隆抗體(1∶100 稀釋)購自Spring Bioscience公司，即用型EGFR單抗及TP53單抗、SP 試劑盒、抗原修復液以及DAB顯色試劑等購自福州邁新生物有限公司。

1.3 免疫組化分析PD- L1、EGFR、TP53的表達

所有標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋組織塊獲得5 μm厚度的連續切片。進行蘇木精- 伊紅染色法 (hematoxylin- eosin staining, HE)染色，采用鏈霉菌抗生物素蛋白- 過氧化酶連接(streptavidin- perosidase, SP)免疫組化方法進行染色，步驟嚴格按試劑盒說明書進行。以磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。在不知患者臨床表現的情況下由兩名病理科醫師采用雙盲法判讀，通過光學顯微鏡在100倍鏡下隨機選擇5個區域進行細胞計數。PD- L1、EGFR在胞膜上或(和)胞漿內計數陽性染色的細胞個數，TP53在胞核內計數陽性染色的細胞個數，分析它們的表達情況。對PD- L1、EGFR、TP53的表達評估采用半定量法分級[6]，即用染色強度×陽性細胞百分比得分，當該得分≥3時判讀為陽性。染色強度的讀取方法：無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為 0、1、2、3分。陽性細胞百分比的讀取方法：陽性細胞百分比≤10%、陽性細胞百分比10%～50%、陽性細胞百分比>50%分別為1、2、3分。

1.4 統計學處理

數據使用SPSS統計軟件(版本24.0，IBM Corp，Armonk，NY)進行統計學分析。率的比較采用卡方檢驗和Fisher- exact檢驗；兩樣本均數的比較采用成組設計t檢驗，對生存數據采用Kaplan- Meier法分析并繪制生存曲線，應用Log- rank檢驗差異性。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PD- L1、EGFR、TP53在肺腫瘤惡性轉變過程中的表達

39例肺腫瘤患者的HE染色及免疫組化結果如圖1，免疫組化染色顯示PD- L1、EGFR在肺腫瘤中的胞漿或(和)胞膜表達，TP53在胞核中表達。在9例AAH、10例AIS和9例MIA患者中均未見PD- L1表達，而在11例IAC中有4例PD- L1陽性表達，表明PD- L1參與浸潤性肺腺癌的發生；EGFR在9例AAH、9例AIS、8例MIA及5例IAC患者中有陽性表達，提示EGFR在早期AAH階段開始陽性表達；TP53在AAH和AIS中無表達，而在MIA中有7例陽性表達，IAC中有9例陽性表達，TP53可能在肺IAC中起重要的作用(表1)。對39例肺腫瘤患者進行臨床相關因素分析發現，患者的年齡、性別、是否吸煙以及PD- L1、EGFR、TP53的表達水平與肺癌由腺瘤性增生向進展期肺腺癌惡性轉變過程相關，有統計學意義(P<0.05)，而血細胞計數里中性粒細胞與淋巴細胞的比率(neutrophil- to- lymphocyte ratio, NLR)及血小板與淋巴細胞的比率 (platelet- to- lymphocyte ratio, PLR)[7- 8]，在各組間的差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 肺腫瘤惡性轉變過程中的相關因素比較

圖1 PD- L1、EGFR、TP53在AAH、AIS、MIA、IAC患者中的表達情況 SP×100

2.2 PD- L1蛋白表達與IAC患者臨床病理特征的相關性

40例(11例+另29例)IAC患者中男26例，女14例，年齡33～75歲。貼壁及腺泡型標本24例，乳頭、微乳頭及實體型16例；伴有淋巴結轉移者17例，不伴有淋巴結轉移者23例。根據TNM分期，Ⅰ期和Ⅱ期患者29例，Ⅲ期和Ⅳ期患者11例。臨床病理特征見表2。PD- L1陽性表達與IAC的病理學類型、是否發生淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤大小具有統計學意義(P<0.05)。

表2 肺腺癌組織中PD- L1的表達及其與臨床病理因素之間的關系

2.3 PD- L1的表達與IAC患者預后的關系

本研究中40例IAC患者的生存時間從手術治療的當日計算，隨訪采取門診復查、電話隨訪相結合，隨訪截止日期為2020年12月30日。術后40例患者獲得隨訪，隨訪率為100%。這些患者中位生存時間為(29.83±1.96)個月。PD- L1陽性表達者15例，中位生存時間(21.67±3.23)個月；PD- L1陰性表達者25例，平均生存時間(34.72±1.88)個月，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。Log- rank檢驗發現，PD- L1在不同表達組之間患者術后平均生存時間存在差異，且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 PD- L1的Kaplan- meier生存曲線

3 討 論

不同組織學類型的肺腺癌發生機制和預后不同，對治療的反應也不同。目前，腫瘤治療已進入精準治療階段，免疫抑制和分子靶向在腫瘤治療中得到廣泛的應用。使用針對免疫檢查點分子的單克隆抗體，例如受體程序性細胞死亡1(programmed cell death 1, PD- 1)或PD- L1，是目前研究的熱點[6]。PD- L1與PD- 1結合抑制免疫 T 淋巴細胞的活化和增殖，參與腫瘤免疫逃逸，促進惡性腫瘤的發生、發展。EGFR的配體與EGFR結合后觸發受體酪氨酸激酶激活一系列下游信號，介導細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡抑制[9]。EGFR- 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)已成為突變敏感肺癌靶向治療的選擇策略，大多患者從TKI中獲益，其可改善肺癌患者的臨床癥狀及延長生存期。TP53是腫瘤抑制基因，位于細胞核，是程序性細胞死亡、細胞周期、DNA修復和基因組穩定性的關鍵調節劑。研究[9]表明，TP53 突變會降低患者對 EGFR- TKI 治療的反應時間，而TP53突變的腫瘤能增加PD- L1的表達。

從AAH到AIS到MIA再到IAC，已被認為是肺腺癌發展的潛在模型。該發展過程不僅由腫瘤的形態學外觀所支持，而且由所涉及的分子發生過程所支持。首先在形態學外觀上[10]，AAH已被認為是肺腺癌的潛在病灶，是一種局部生長緩慢且直徑<0.5 cm的病變，為局限于肺泡和呼吸細支氣管的立方或柱狀上皮細胞層的不典型增生。AIS是一種直徑≤3 cm的腺癌，可分為非黏液性和黏液性，黏液性非常罕見，大多數非黏液性AIS由Ⅱ型肺泡壁細胞和(或)Clara細胞組成。MIA被定義為浸潤灶的最大徑≤5 mm，直徑≤3 cm的腺癌，主要呈附壁式生長。MIA通常是非黏液性的，黏液性少見。IAC是指浸潤灶的最大徑>5 mm，直徑以≥5 cm的腺癌，IAC的病灶通常由多個小浸潤灶生長并融合而成，根據IAC的主要生長模式將其分為貼壁及腺泡型，乳頭、微乳頭及實體型。其次在分子發生過程上[10]，AAH中存在染色體9q和16p雜合性缺失，EGFR、BRAF、KRAS、FGFR3和ERBB2突變，CCND1(細胞周期蛋白D1)的高表達水平、CDKN2A的低表達水平和表觀遺傳下調。AAH具有在肺腺癌中觀察到的一些分子改變，這支持了從AAH到肺腺癌的進展過程。在病變發展過程中，AIS是AAH和MIA之間的中間步驟，端粒縮短和DNA損傷反應(DNA damage responses, DDR)被認為是肺癌致癌的早期事件。DDR蛋白的表達水平和編碼端粒特異性DNA結合蛋白的TERF1和TERF2的mRNA，與AAH向AIS的進展有關。MIA是一種早期浸潤性腺癌，因此，它的遺傳改變與允許入侵的分子事件有關。肺腺癌通過多步連續譜的侵襲性與多種分子事件有關。對于含有EGFR突變的腺癌，EGFR擴增參與了從AIS到MIA的轉變。TTF- 1擴增通常與EGFR擴增同時發生。TP53突變的頻率在侵襲性腫瘤發展過程中增加。

在侵襲性腫瘤中，等位基因失衡區域的數量更高。層粘連蛋白5是一種入侵相關分子，在從AIS到MIA的過程中被激活。IAC與 KRAS突變和HNF4α表達水平上調有關，TP53通常在IAC發生突變，TP53突變與癌癥的浸潤性潛在能力相關[11- 12]。

結合本研究結果，我們在39例不同病理分型的肺腫瘤中發現PD- L1在IAC中陽性表達，表明PD- L1參與肺腺癌的發生發展；EGFR在早期的AAH、AIS階段都有陽性表達，表明EGFR是早期發生事件；TP53突變在MIA、IAC中有陽性表達，而在AAH及AIS中未見表達，表明TP53突變可能在浸潤性肺腺癌中起重要的作用，TP53是在腫瘤進展過程中的相對較晚的分子事件。當前大多數研究分析均基于已切除的腫瘤，有一個從AIS到MIA以及最終到IAC的病理過程線性模型的假設[1]。但是，是否所有AIS都進展到MIA或IAC，以及每個IAC是否遵循從AIS到MIA到IAC的演變軌跡，都是未知的。因此，在未來的研究中應將更明確的終點(如無復發生存期和總生存期)與分子特征結合起來，以定義這些肺癌病變的分子亞型。

大部分肺GGNs中病理表現為IAC，其惡性程度高，預后差。免疫治療開啟了肺癌患者治療的新篇章，許多肺癌患者能從免疫治療中獲益，提高生存期。抑制PD- 1及其配體PD- L1，已成為包括肺癌在內的許多惡性腫瘤的重要免疫治療方法[6]。在臨床實踐中使用常規處理的組織學切片，免疫組化分析PD- L1表達，對于判斷患者是否能夠接受PD- 1/PD- L1免疫療法至關重要，定量檢測其表達可能有助于監測治療反應。本研究中我們對40例IAC組織標本進行免疫組化檢測，發現PD- L1 蛋白陽性表達率為37.5%(15/40)，PD- L1陽性表達與肺腺癌病理學分型、是否發生淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤大小之間有關聯性。我們還檢驗了PD- L1表達與IAC預后的關系，PD- L1陽性表達的IAC患者生存率比PD- L1陰性表達低。表明PD- L1表達是IAC的不良預測因子，PD- L1與肺癌復發與進展相關。

NLR和PLR可以表明患者的總體炎癥狀態，而炎癥反應與腫瘤的發生、發展及預后密切相關[13]。許多機構研究了NLR、PLR作為全身性炎癥的指標代表，以鑒定其與肺癌患者生存的關系。但是，這些研究大多數樣本量有限，并且結果不一致[14]。本研究發現，入組的不同類型肺腫瘤的 NLR、PLR在各組間無差異，不排除樣本例數較少的原因。因此，需要更多的研究來證實NLR、PLR與肺腫瘤惡性轉變過程的關系。

了解肺腺癌的分子發病機制對于制定有效的預防和治療策略至關重要。本研究為肺腫瘤發生發展、制定有效的預防策略以及進行免疫治療提供了初步證據,但單純基于形態學的早期病理診斷可能無法全面評估病灶整體腫瘤生物學活性，存在一定局限性，需要縱向活檢和快速發展技術(例如液體活檢和放射學)的臨床試驗可能會為進化過程提供新的見解。因此，后續基于影像學及單細胞技術，可能更深入全面分析肺癌由腺瘤性增生向進展期肺腺癌惡性轉變過程中的分子表達差異和預后特點。