類風濕關節炎組織CD109表達與疾病嚴重程度及局部炎癥反應的關系研究>

丁寧，王敬君，劉歡，李翠紅>

(鐵嶺市中心醫院 血液風濕免疫科，遼寧 鐵嶺 112000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性炎癥和成纖維樣滑膜細胞增生(fibroblast- like synoviocytes，FLSs)為特征的免疫性疾病[1]，FLSs屬于侵襲性表型，產生過多的促炎細胞因子和基質降解酶，導致關節功能障礙和破壞[2]。因此，鑒定特異性靶向FLSs介導的炎癥反應的關鍵因子可能為 RA提供新的治療靶點。CD109是一種細胞表面抗原，作為一種糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白，CD109在各種腫瘤中的表達增加表明了更具侵襲性的表型和不良的預后[3]。由于FLSs表現出腫瘤樣增殖和侵襲行為，CD109可能在其中發揮作用。據報道，CD109與葡萄糖調節蛋白78(glucose- regulated protein 78，GRP78)相互作用，抑制轉化生長因子β(transforming growth factor- beta，TGF- β)信號傳導以應對內質網應激[4]，而GRP78是導致RA加重的重要病理因素[5]，推斷CD109可能參與RA的病理進展。然而該推斷尚缺乏臨床證據支持。本研究旨在探討CD109在RA患者滑膜組織中的表達水平與疾病嚴重程度及關節局部炎癥反應的關系，為尋找新的治療靶點提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采集了56例符合《2018年中國類風濕關節炎診療指南》[6]及2010年美國風濕病協會和歐洲抗風濕聯盟制定的診斷標準[7]的RA患者(研究組)的滑膜組織，所有患者均于2019年2月至2020年1月在我院進行滑膜切除術或關節置換手術。研究組中男21例，女35例；平均年齡(56.13±7.37)歲；病程26～130個月，平均(57.09±21.06)個月。28個關節計數和CRP濃度(disease activity score in 28 joints with C- reactive protein，DAS28- CRP)評分≥2.6分，臨床資料完整，手術前所有患者均使用改善疾病的慢作用抗風濕藥物，包括甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羥氯喹、來氟米特，而沒有使用生物制劑。另外選取30例接受全關節置換術的膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)患者作為對照組，其中男15例，女15例；平均年齡(54.83±6.45)歲。所有患者排除其他免疫系統疾病、全身感染性疾病、惡性腫瘤、其他基礎性疾病者。兩組患者年齡、性別構成等一般因素一致，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到我院機構評審委員會的批準，并根據赫爾辛基宣言的建議進行推進?；颊咴诓杉瘶颖厩岸己炇鹆藚⑴c研究的知情同意書。

1.2 臨床和實驗室評估

56例RA患者在基線時接受臨床評估，包括腫脹關節的數量(評估28個關節)和受累關節的數量(評估28個關節)。采用DAS28- CRP評分低活動度(2.6～3.2分)、中活動度(>3.2～5.1分)、高活動度(>5.1分)對患者進行亞組分析。實驗室檢測包括患者全血細胞計數、類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體水平、C反應蛋白(CRP)和紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)水平。

1.3 關節滑液炎癥因子檢測

手術前3 d采集RA患者關節滑液(synovial fluid，SF)樣本1 ml，取樣后即刻用1 μg·ml-1透明質酸酶處理，1 000 r·min-1離心5 min。上清液3 000 r·min-1離心10 min去除不溶性物質。樣本保存在-80 ℃，6個月內完成檢測。將含有可見血液的SF樣本排除，用微量樣本多指標流式蛋白定量技術(Cytometric Bead Array，CBA)檢測SF樣本中的細胞因子，包括白細胞介素(interleukin，IL)- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP- 3)、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- alpha，TNF- α)、轉化生長因子(TGF)- β1。

1.4 組織CD109測定

取RA和KOA手術患者的滑膜組織，石蠟包埋，用10% 乙二胺四乙酸脫鈣，采用親和純化的單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)檢測滑膜組織CD109表達。先用0.3% 的過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，將組織切片與稀釋的正常山羊血清孵育，然后與親和純化的鼠抗人CD109多克隆抗體(1∶25稀釋)孵育過夜(8～10 h)，以同型配對抗體作為對照，以堿性磷酸酶標記的親和純化的抗鼠IgG作為第2抗體孵育30 min，清洗后用APAAP復合物共同孵育30 min，用二氨基聯苯胺(DAB)染色，結果呈棕色，最后切片用蘇木精進行反染色。由兩名獨立的觀察者計算不同細胞群的陽性細胞數量[細胞膜和(或)細胞質棕色染色]和總細胞數(藍色染色)，每個標本至少隨機選取5個視野。采用二級積分法進行半定量分析,以陽性染色百分比×染色強度作為總積分指數:-(<1分)、+(1～3分)、++(4～6分)、+++(7～12分)。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組患者組織CD109陽性表達情況

與對照組比較，研究組的組織CD109陽性表達率顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。兩組患者組織CD109陽性表達情況見圖1。

表1 兩組的組織CD109表達情況

A.研究組；B.對照組

2.2 RA患者組織CD109陽性表達與疾病活動度的關系

低活動度組、中活動度組和高活動度組3個亞組比較，患者RA病程、RF+、CCP+、CRP、ESR、組織CD109表達差異均具有統計學意義(P<0.05)。與低活動度組相比，中活動度組和高活動度組病程、CCP+、CRP、ESR以及組織CD109表達均升高(P<0.05)，同時中活動度組RF+高于低活動組；與中活動組相比，高活動度組病程、CRP、ESR、組織CD109表達顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 比較不同DAS28- CRP評分RA患者基本臨床資料

2.3 多元線性回歸分析組織CD109表達與疾病活動度的關系

以DAS28- CRP作為因變量，納入性別、年齡、病程、RF、CCP、CRP、ESR以及組織CD109作為自變量，經多元線性回歸分析，CRP、組織CD109表達是影響RA患者疾病活動度的獨立臨床因素(P<0.05)，見表3。

表3 多元線性回歸分析與RA患者疾病活動度相關的臨床因素

2.4 RA患者組織CD109陽性表達與關節局部炎癥因子的關系

與CD109-組比較，CD109++組和CD109+++組IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α水平顯著上升(P<0.05)，同時CD109+++組TGF- β1顯著下降(P<0.05)，見表4。經Spearman等級相關性檢驗，RA患者組織CD109表達與IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α水平呈正相關性(P<0.05)，與TGF- β1水平呈負相關(P<0.05) ,見表5。

表4 比較組織CD109不同表達情況的RA患者關節滑液中IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1水平差異

表5 RA患者組織CD109與IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1的相關性

3 討 論

抑制炎癥反應是治療 RA的研究重點。本項研究中我們發現，RA患者關節滑膜組織CD109陽性表達與疾病活動度較高以及關節局部炎癥反應加重有關。CD109是一種細胞表面抗原，屬于α2- 巨球蛋白/C3、C4、C5家族的硫酯類蛋白[8]。CD109作為一種糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白主要表達于細胞表面，尤其是在各種腫瘤組織中表達上調，這與腫瘤細胞更具侵襲性表型和預后不良有關。例如車瀟良等[9]學者證實CD109在人宮頸鱗狀細胞癌中呈高表達，且在非角化型鱗狀細胞癌中表達水平高于角化型，推測其在宮頸鱗狀細胞癌的發生、增殖、分化中起重要作用。Liu等[10]通過檢測銀屑病組織樣本中CD109、SMAD7、TGF- β1等因子的表達，證實CD109屬于一種新的轉化生長因子輔助受體，通過增強SMAD7依賴的轉化生長因子Ⅰ型受體(TGF- β type Ⅰ receptor)表達來抑制TGF- β1信號傳導，進而在銀屑病中表達異常。此外Song等[11]通過分裂RA患者滑膜組織中的FLSs細胞證實，抑制組織CD109表達后，細胞培養上清中IL- 6、IL- 8、IL- 1β以及MMP- 3水平明顯降低，而且敲除CD109基因后可明顯降低TNF- α或IL- 1β誘導的絲氨酸/蘇氨酸激酶、核轉錄因子- kappa b、 STAT3和 p38 MAPK信號蛋白的磷酸化水平?？傊鲜鰯祿砻饕种艭D109在限制 FLSs介導的炎癥反應中具有十分重要的作用。本研究中我們通過檢測關節滑液中IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1水平也發現，組織CD109表達與IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α呈正相關性，與TGF- β1呈負相關， IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1都參與了RA FLSs介導的炎癥反應，因此這也說明CD109可能是介導FLSs分泌促炎因子的重要介質。然而之前也有研究發現，雖然CD109能夠抑制TGF- β1信號轉導和隨后的纖維化進程，但是CD109蛋白水平升高的成纖維細胞仍然能夠產生細胞外間質分子。因此，可能抑制CD109表達并不足以完全抵消TGF- β1激活對纖維化的影響，關于具體的作用機制尚需要進一步研究證實。

RA是一種常見的全身性、異質性和自身免疫性疾病，以慢性、浸潤性和對稱性小關節炎為主要臨床特征，可影響肺、腎臟和心臟等多個器官。目前，該病的發病機制尚未明確。大多數學者認為，這是由于免疫系統紊亂，如由多種外源性感染因素或遺傳易感性等導致B淋巴細胞失衡、 T淋巴細胞亞群異常激活等所致[12]。作為近年來發現的一種新型CD4+T細胞亞群，濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells，Tfh)的主要功能是協助維持淋巴細胞平衡和誘導機體的免疫應答。Tfh可分泌大量免疫炎癥因子，如IL- 6、IL- 17A等[13]，這兩個因子與TGF- β1相互作用，活化大量參與機體免疫反應的T淋巴細胞。IL- 6、IL- 17A是人體免疫調節的關鍵因素，能促進細胞分化、刺激細胞生長、調節免疫反應，從而參與人體的應激反應[14]。TGF- β1則是一種重要的促成骨細胞因子，能抑制破骨細胞的形成，促進成骨細胞的發育，促進骨形成[15]。MMP- 3是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，它不僅降解骨質和軟骨，損傷RA患者的關節，而且還誘導其他基質金屬蛋白酶發揮生物學作用，破壞人體的關節[16]。本研究中滑膜組織CD109表達與滑液樣本中TGF- β1、MMP- 3水平有關，而且經多元線性回歸分析顯示，滑膜組織CD109表達與RA患者疾病活動度呈獨立正相關，這也說明CD109是參與RA疾病進展的重要分子，并且有望成為RA 治療的新靶點。

綜上所述，滑膜組織CD109表達量升高與RA疾病活動度呈正相關，并且對關節局部炎癥因子如IL- 6、IL- 8、TNF- α等的分泌有一定的促進作用，提示CD109可能是RA治療的候選因子。