中性粒細胞型哮喘患兒急性發作期血清顆粒蛋白前體與疾病嚴重程度及氣道炎癥的關系>

雷芳，龔霞>

(重慶市大足區人民醫院 兒科，重慶 402360)

哮喘是一種發病機制復雜、涉及多種細胞及細胞組分的慢性氣道異質性炎癥性疾病。根據痰嗜酸粒細胞(EOS)和中性粒細胞(NEU)的比例，哮喘可分為4種炎癥亞型，其中中性粒細胞型哮喘(neutrophilic asthma，NA)在兒童群體中，尤其是嚴重哮喘表型中十分常見[1- 2]。氣道NEU與哮喘惡化、氣流受限及類固醇抵抗有關，因此與EOS型哮喘相比，NA患兒肺功能下降更嚴重、急性發作次數更多，且哮喘標準治療對NA的治療效果差強人意[3]。近幾年，眾多研究集中在研究哮喘不同表型的病理生理學機制方面，試圖確定其潛在的治療靶標。生物標志物是一些生物狀態或微環境的定性或定量指標，與疾病的發生、嚴重程度、病理生理學進展以及治療反應性或預后有關。血清顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種具有抗炎和免疫調節活性的多效性糖基化蛋白原。最近，Horinokita等[4]發現NEU彈性蛋白酶可以切割PGRN，進而釋放顆粒蛋白；此外PGRN可抑制NEU脫顆粒和阻斷腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor α，TNF- α)信號的傳遞，而TNF- α信號通路激活被認為是參與氣道NEU性氣道炎癥和氣道高反應性的重要分子機制[5]。然而，PGRN水平是否可作為一個新的反映哮喘嚴重程度的血清學指標尚不清楚，故而本研究對血清PGRN水平與NA患兒氣道炎癥的關系，以及其對NA患兒急性發作的輔助診斷價值和臨床意義進行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在這項觀察性隊列研究中，185例年齡在6～14歲之間的哮喘患兒被納入研究，處于哮喘急性發作期的患兒115例(急性組)，其中男67例，女48例，平均年齡(9.63±2.48)歲；處于臨床緩解期的患兒70例(緩解組)，其中男44例，女26例，平均年齡(9.30±2.87)歲。所有參與者均來自于2019年1月至10月期間在我院兒科就診的患兒。納入標準：(1) 年齡在6～14歲之間，符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]診斷標準；(2) 急性組患兒首次發病，具有典型的臨床癥狀及體征(排除其他疾病因素)，且發病至血樣采集時間≤48 h；經運動激發試驗或支氣管激發試驗陽性，結合CT檢查和實驗室檢查結果等明確哮喘診斷；(3) 臨床緩解期患兒哮喘癥狀體征消失，第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)，或者最大呼氣峰值流速(peak expiratory flow，PEF)≥80%預計值，且維持3個月及以上。排除標準：(1) 近1個月內接受激素或免疫抑制劑治療者；(2) 合并過敏性鼻炎、結核感染、肺炎、肺功能不全或其他器官嚴重感染者。另外選取30例健康兒童作為對照組，其中男16例，女14例，年齡6～14歲，平均年齡(9.93±2.78)歲，體格檢查和肺功能檢查正常，排除任何感染性疾病、哮喘病史、過敏病史、免疫系統疾病等以及近1個月內接受激素或免疫抑制劑治療者。急性組、緩解組和對照組年齡、性別構成因素一致，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案獲得我院醫學倫理委員會批準和法定監護人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 痰誘導檢測 急性組及緩解組患兒參照歐洲呼吸協會誘導痰液指導小組制訂的指南，痰液誘導前吸入400 μg沙丁胺醇10～15 min；生理鹽水漱口后用3%高滲鹽水超聲霧化吸入，囑患兒主動咳痰。將3 ml痰液置于無菌試管中，加入4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，在37 ℃水浴中孵育15 min，用離心機3 500 r·min-1離心10 min。沉淀物進行涂片并對細胞分類計數。鏡檢視野中鱗狀上皮細胞/有核細胞<20%痰涂片可用。根據痰液NEU是否≥61%以及EOS是否≥3%，將患兒分為NEU型(EOS<3%，NEU≥61%)、EOS型(EOS≥3%，NEU<61%)、混合型(EOS≥3%，NEU≥61%)和寡細胞型(EOS<3%，NEU<61%)。

1.2.2 肺功能檢查和病情嚴重程度分級[7]所有患兒在痰誘導前采用AS- 507肺功能檢查儀(日本美能公司)檢測用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、FEV1，計算FEV1占預計值的百分比(FEV1% pred)和FEV1/FVC，另外測定PEF。根據肺功能檢查，將患兒分為輕度、中度和重度組。

1.2.3 血清PGRN、炎癥因子測定 所有患兒分別采取外周靜脈血3、5 ml，將5 ml靜脈血3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于-80 ℃儲存待測，采用酶聯免疫吸附法(enzyme- linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清PGRN、TNF- α、白細胞介素(interleukin，IL)- 8水平，試劑盒購自美國R&D公司；3 ml靜脈血采用SF- 3000型自動全血分析儀(日本SYSmex公司)檢測全血NEU。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 3組患兒血清PGRN水平比較

急性組、緩解組、對照組患兒血清PGRN水平分別為(26.29±10.62)、(38.95±5.73)、(45.37±3.17)ng·ml-1，急性組和緩解組患兒血清PGRN水平低于對照組，尤其是急性組患兒血清PGRN水平降低更明顯，差異有統計學意義(F=84.205，P<0.001)。

2.2 兩組哮喘患兒氣道炎癥分型以及血清PGRN水平比較

對于緩解組患兒，比較4個亞型血清PGRN水平，差異無統計學意義(F=0.177，P=0.912)。但是對于急性組患兒，NEU型和混合型哮喘患兒血清PGRN水平低于EOS型和寡細胞型哮喘患兒，差異有統計學意義(F=69.148，P<0.001)，但是NEU型與混合型哮喘患兒血清PGRN水平差異無統計學意義(q=0.194，P>0.05)。見表1。

表1 兩組哮喘患兒氣道炎癥亞型分布和血清PGRN水平比較

2.3 NA急性發作期患兒血清PGRN水平與肺功能的關系

NA急性發作期患兒隨著疾病嚴重程度的加重，各項肺功能指標(FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF)和血清PGRN水平逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。另外經Pearson相關性分析顯示，NA急性發作期患兒血清PGRN水平與FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF均呈正相關，r=0.756、0.703、0.411，P<0.001，見圖1。

圖1 NA患兒急性發作期時血清PGRN水平與肺功能指標的關系

表2 NA急性發作期患兒不同疾病嚴重程度血清PGRN水平和肺功能指標的差異

2.4 單因素和多因素分析影響NA急性發作期患兒疾病嚴重程度的危險因素

經單因素分析顯示，血清PGRN水平每升高1 ng·ml-1時NA急性發作期患兒進展至重度的危險率為0.877(95%CI：0.841～0.930，P<0.001)。進一步校正年齡、性別、肥胖、痰液NEU和EOS百分比后，血清PGRN水平升高仍是NA急性發作期患兒重度疾病的獨立保護因素(OR=0.886，95%CI：0.847～0.958，P<0.001)。見表3。

表3 單因素和和多因素分析影響NA急性發作期患兒疾病嚴重程度的危險因素

2.5 血清PGRN水平對重度NA急性發作期患兒的診斷價值

經ROC曲線分析顯示，血清PGRN水平診斷NA急性發作期患兒重度疾病的AUC為0.876(95%CI：0.781～0.972)，cut- off值為19.51 ng·ml-1，在該閾值下靈敏度和特異度分別為73.90%和88.50%，約登指數為0.624，見圖2。

圖2 血清PGRN水平對NA急性發作期患兒重度疾病的診斷ROC曲線

2.6 NA急性發作期患兒血清PGRN水平與氣道炎癥的關系

經Pearson相關性分析顯示，NA急性發作期患兒血清PGRN水平與血清TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計數均呈負相關，r=-0.537，-0.541，-0.413，P<0.001，見圖3。

圖3 血清PGRN水平與血清TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計數的Pearson相關性

3 討 論

本研究中我們評估了血清PGRN水平在不同氣道炎癥亞型的哮喘患兒急性發作期、臨床緩解期表達水平的變化，對于以NEU氣道浸潤為主的哮喘患兒，急性發作期時血清PGRN水平顯著低于臨床緩解期；而對于以EOS增多為主的哮喘患兒，血清PGRN在急性發作期和臨床緩解期的表達水平變化并不明顯。說明血清PGRN水平降低與NEU增多之間存在一定的聯系，而且對于NA患兒在急性發作期時，隨著疾病嚴重程度的加重血清PGRN水平逐漸降低，并且與主要肺功能指標(FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF)呈正相關，說明PGRN參與了NA的發生和進展過程。另外TNF- α和IL- 8是調節氣道炎癥反應的重要細胞因子，血清PGRN水平與TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計數呈負相關，說明PGRN與NEU性氣道炎癥有關，這可能是誘發嚴重NA的重要原因。

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，這種異質性反映在病理學、臨床進展過程和對標準治療反應性的差異。了解造成異質性的分子機制可為患者的個體化治療提供一定的理論基礎，例如，抗白細胞介素- 5和抗IgE分別用于治療EOS炎癥和2型輔助性T細胞(type 2 T- helper cell)升高為主的重癥哮喘患者。但是目前針對NEU氣道炎癥優勢浸潤的哮喘尚無有效的治療策略，這與對這些患者哮喘發病機制認識不足有關。雖然NEU表型可見于大多數哮喘患兒，但從比例上分析，在嚴重哮喘表型中更為常見，這可能是因為NEU性氣道炎癥與氣道微生物菌群組成、哮喘惡化、空氣受限和類固醇抵抗等因素有關[8- 9]。Grunwell等[10]認為NA患兒氣道NEU機能障礙，使促炎癥介質和顆粒釋放更多，導致平滑肌收縮、黏膜水腫、呼吸道上皮結構損壞及呼吸道重構，引發支氣管狹窄、肺功能下降。除此以外，在本研究中我們發現血清PGRN水平降低也是NA患兒急性發作期肺功能降低和氣道炎癥反應加重的重要原因之一。

PGRN是一種分泌型、多功能糖蛋白，在支氣管上皮細胞中呈高表達，屬于一類強有力的抗炎分子，其抗炎作用是通過抑制NEU脫顆粒進而激活TNF- α相關炎癥信號通路而實現的[11]。PGRN可被多種基質金屬蛋白酶類、NEU彈性蛋白酶等降解，形成顆粒蛋白發揮促炎作用，并中和PGRN的抗炎作用[12]。例如，顆粒蛋白B可刺激氣道上皮細胞中IL- 8的表達，誘導NEU吞噬和殺菌性能增加[13]。目前為止，已知有20多種蛋白可與PGRN結合，尤其是富含半胱氨酸的腫瘤壞死因子受體1/2(tumor necrosis factor receptor，TNFR1/2)，Tang等[14- 15]證實，PGRN與TNFR1和TNFR2的結合能力基本一致，但是都遠遠高于TNF- α。哮喘的特征之一是支氣管高反應性，即由各種特異性和非特異性刺激引起的過度支氣管痙攣。這種反應在健康人群中是不會發生的，但是這種現象的病理機制尚不完全清楚。眾所周知，不同的哮喘表型其氣道反應性也有所差異，這強調了氣道上皮細胞的重要性。上皮細胞分泌炎癥細胞因子以及支氣管收縮/擴張因子，如IL- 6、IL- 8、TNF- α等通過直接改變氣道平滑肌的特性而參與氣道高反應性的發生。對于嚴重的EOS型哮喘，2型免疫細胞因子(如IL- 4、IL- 5和IL- 13)的過度產生被認為是關鍵的病理機制。阻斷這些分子或其受體的生物制劑的開發，以及證實其有效性和安全性的臨床試驗正在不斷進行。因此，PGRN/TNF- α信號通路有望成為一種新的抑制NEU型氣道高反應性的潛在機制。

為了支持上述推斷，在本研究中我們通過單因素和多因素Logistic回歸分析證實，血清PGRN水平降低是NA急性發作期患兒哮喘加重的獨立危險因素，并且低水平的血清PGRN可作為重度NA的診斷指標，而且作為NEU相關抗炎因子，血清PGRN水平降低也反映了NEU性氣道炎癥狀態。例如，Chen等[16]使用人痰標本評估了PGRN可能對慢性阻塞性肺疾病的影響，發現痰PGRN水平與NEU彈性蛋白酶和蛋白酶3等NEU炎癥標志物呈負相關，而且血清PGRN水平降低可作為慢性阻塞性肺疾病急性加重的一個獨立預測因素。雖然PGRN在NEU氣道炎癥發生發展中的確切作用機制尚不清楚，但我們的試驗結果證實了血清PGRN水平降低與氣流受限引起的重度NA有關，同時血清TNF- α、IL- 8水平降低且全血NEU計數增高。而且我們校正一些重度哮喘的高危因素后，血清PGRN仍然是NA急性發作期患兒哮喘加重的獨立影響因素。嚴重哮喘對于哮喘的治愈是個非常重要的障礙，其肺功能降低、氣流受限程度加重以及小氣道重構等都增加了臨床治療的困難。在本研究中我們只是初步鑒定了PGRN可能是重度NEU型急性發作期哮喘的生物學標志物之一，未來還需要加深對PGRN分子機制的研究，并結合已知的細胞因子和趨化因子等進一步確認PGRN在NEU性氣道炎癥調節中的作用。

綜上所述，NA患兒急性發作期血清PGRN水平較臨床緩解期有所降低，而且與嚴重哮喘和NEU型氣道炎癥有關。因此檢測血清PGRN水平可以反映NA患兒急性發作期的疾病嚴重程度，其有望成為一種新的抑制NEU型氣道高反應性的潛在靶點。