聚乳酸/羥基乙酸可降解藥物釋放支架的探索>

劉琳琳，秦娟，曾楚慧，杜瑞杰，陸驪工，陳磊，滕皋軍，朱海東，何仕誠(chéng)>

消化道良性狹窄多見(jiàn)于食道反流、食道腐蝕、克羅恩病、膽道吻合術(shù)后及食管、胃吻合術(shù)后[1]。吞咽困難及消化液潴留是該類疾病最常見(jiàn)的癥狀，并最終導(dǎo)致患者營(yíng)養(yǎng)不良、體重減輕和生活質(zhì)量下降等[2- 3]。良性食管狹窄是食管良性疾病中最常見(jiàn)的類型，內(nèi)鏡下食管擴(kuò)張是目前臨床上主要治療方法[4- 6]，但相當(dāng)一部分患者需要反復(fù)擴(kuò)張，致其生活質(zhì)量下降、且增加醫(yī)療成本[7]。暫時(shí)性植入支架可有效延長(zhǎng)通暢時(shí)間，但傳統(tǒng)金屬支架植入后須二次手術(shù)取出，且支架植入部位的組織增生常導(dǎo)致支架嵌入食管腔內(nèi)，增加取出的難度及患者的痛苦[4,8- 9]。為了解決這些問(wèn)題，生物可降解支架被認(rèn)為是一種很有前途的替代材料，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景[10- 12]。臨床研究表明，對(duì)于難治性的良性食管狹窄，擴(kuò)張后放置可吸收支架可有效延長(zhǎng)擴(kuò)張后食管通暢的時(shí)間以及降低再狹窄發(fā)生率[10]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將生物可降解的聚乳酸/羥基乙酸(polylactic acid- co- glycolic acid, PLGA)與抗增殖藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)相結(jié)合，探索PLGA作為制備載藥生物可降解支架材料的生物相容性和可行性，為后期研發(fā)可應(yīng)用于治療良性消化道(食管、膽道等)狹窄的生物可降解載藥支架作準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 膜片制備 將PLGA(0.85 dl·g-1，LA/GA 50/50，山東省醫(yī)療器械研究所)與PTX(C47H51NO14，≥98%，南京格魯科生物科技有限公司)按照質(zhì)量比10∶0、9∶1和8∶2比例混合，溶解在二氯甲烷中得到藥物含量分別為0、10%和20% 3種混合溶液。然后將混合溶液澆筑在玻璃培養(yǎng)皿中，待二氯甲烷充分揮發(fā)干燥后得到含有不同藥物濃度的PTX- PLGA膜，將制備好的PTX- PLGA膜片通過(guò)掃描電鏡觀察其表面特征及藥物分布情況。

1.1.2 細(xì)胞提取 新西蘭白兔由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有方案均已獲得本機(jī)構(gòu)動(dòng)物研究委員會(huì)的批準(zhǔn)，并按照國(guó)際動(dòng)物保護(hù)理事會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行。取10～11周齡、2.3～3.8 kg的健康兔，雌雄不限，用1.5 ml 4% NaOH腐蝕兔食管，注射時(shí)間持續(xù)30 s，造成食管的良性狹窄，隨后立即用生理鹽水反復(fù)沖洗3次，避免殘留腐蝕劑繼續(xù)對(duì)食管造成損傷。操作結(jié)束后對(duì)所有動(dòng)物不禁食、不禁飲，每天觀察動(dòng)物的進(jìn)食量及活動(dòng)度等狀態(tài)，每周測(cè)量動(dòng)物體重。食管造影檢查每?jī)芍苓M(jìn)行1次，當(dāng)腐蝕處食管最狹窄處達(dá)到正常食管最大處直徑的1/2時(shí)即為造模成功。造模成功后處死并取狹窄段的食管，采用干貼壁法提取食管成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)至第3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 體外降解實(shí)驗(yàn) 通過(guò)在pH值為7.4和4.0兩種磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中孵育測(cè)定PTX- PLGA膜在質(zhì)量損失方面的降解行為。將制備好的載藥PLGA膜片裁剪成1 cm×1 cm大小的正方形膜片，將預(yù)稱重的標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，分別放入兩種pH的PBS 3 ml，于37 ℃、110 r·min-1的恒溫振蕩器中降解，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)回收3個(gè)重復(fù)的樣品。質(zhì)量損失是通過(guò)計(jì)算某一特定時(shí)間點(diǎn)剩余的干重量與初始重量來(lái)確定。

1.2.2 體外藥物釋放 將1 cm2膜片置于3 ml PBS中(pH=7.4, pH=4.0)，按照指定時(shí)間定期取出釋放介質(zhì)作為樣品，并換上新鮮3 ml PBS繼續(xù)進(jìn)行藥物釋放。將取出的樣品加入1 ml二氯甲烷萃取過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞毒性檢測(cè) 用不載藥的1 cm2膜片與培養(yǎng)基共同孵育24 h后制備成浸提液，用無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾后備用。將浸提液設(shè)置為4個(gè)不同的梯度(100%、75%、50%、25%)，與提取的成纖維細(xì)胞分別共培養(yǎng)，24、48 h后用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)并與空白對(duì)照組比較。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 含有PTX的膜片會(huì)隨著PLGA的降解緩慢釋放，用不同藥物含量(0、10%、20%)的膜片浸提液培養(yǎng)提取的成纖維細(xì)胞48 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組浸提液對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PTX- PLGA表面特征評(píng)價(jià)

載藥PLGA膜片中PLGA能夠很好地溶解，不含未溶解的雜質(zhì)，PTX能很好地與PLGA混溶并在PLGA膜中均勻分布。在適度拉伸和彎折后PLGA膜片未出現(xiàn)明顯的裂痕，前期膜片能夠均勻降解。見(jiàn)圖1。

a、b.不同放大倍數(shù)的電鏡圖像顯示;c.PTX結(jié)晶體均勻地溶解到PLGA膜片中；d、e.降解21 d后的電鏡圖顯示膜片均勻降解。圖中白色箭頭所指為膜片表面的灰塵等雜質(zhì)

2.2 PTX- PLGA體外降解

PLGA降解時(shí)間可以通過(guò)調(diào)整分子量及LA/GA之值進(jìn)行調(diào)控。PTX- PLGA在pH值分別是7.4和4.0的緩沖液中前兩周降解均較緩慢，從第3周開(kāi)始降解速度逐漸增快。在第1、2、4周的質(zhì)量損失分別為pH=4.0時(shí)的(3.13±0.43)%、(3.73±0.11)%、(23.76±1.62)%)，pH=7.4的(2.09±0.26)%、(2.91±0.60)%、(17.35±0.55)%，到第10周時(shí)，在pH=4.0的降解液中材料基本降解完全。膜片在酸性降解液(pH=4.0)中的降解速度快于中性降解介質(zhì)(pH=7.4)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 PTX- PLGA膜片在兩種pH的PBS中的降解曲線

2.3 藥物釋放

圖3為體外28 d藥物釋放曲線。在第13天時(shí)藥物釋放逐漸加快，載藥量10%的PTX- PLGA膜片連續(xù)28 d藥物釋放總量分別為(137.26±11.35) μg·ml-1(pH=4.0)、(102.73±6.94) μg·ml-1(pH=7.4)；載藥量20%的為(296.33±9.57) μg·ml-1(pH=4.0)、(245.64±16.24)μg·ml-1(pH=7.4)。

圖3 不同載藥量的PTX- PLGA膜片在兩種pH值的PBS中的藥物釋放曲線

2.4 膜片毒性與細(xì)胞凋亡評(píng)估

將不同濃度梯度的浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)24、48 h后，細(xì)胞的吸光度與不含浸提液的空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.62/2.86，P>0.05，圖4)。培養(yǎng)48 h 的流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：相較空白對(duì)照組，10%和20%的載藥量組能促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)，并且隨著載藥量的增加凋亡逐漸增多，載藥量為20%時(shí)晚期凋亡率超過(guò)10%，10%組與20%組的細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

a、b、c、d.分別為空白對(duì)照、載藥量為0、載藥量為10%、載藥量為20%組

3 討 論

聚乳酸(polylactic acid)、左旋聚乳酸(poly-L- lactic acid, PLLA)、PLGA等[13- 14]諸多聚合物材料，因其良好的生物相容性、相對(duì)穩(wěn)定的機(jī)械和降解性能被廣泛應(yīng)用于生物可降解支架的研究設(shè)計(jì)[15- 16]。PLLA作為生物可降解支架材料的缺點(diǎn)之一是其在體內(nèi)大約6個(gè)月便失去機(jī)械強(qiáng)度，但質(zhì)量損失的時(shí)間要長(zhǎng)得多，完全吸收需要2～5年[17]。目前對(duì)于以PLLA為基材的生物可降解支架的設(shè)計(jì)并未達(dá)到臨床上理想的應(yīng)用效果，因此本研究設(shè)計(jì)選材為PLGA，其較PLLA最大的優(yōu)點(diǎn)之一是降解速率明顯加快。此外，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，不同分子量以及不同LA/GA值的PLGA顯示出不同的降解性能和柔順性：分子量越大、LA比例越高，降解速度則越慢，并且隨著LA比例增高，其剛性也相應(yīng)增加。因此，對(duì)以PLGA作為支架的基材，可以根據(jù)不同需求，通過(guò)調(diào)節(jié)分子量以及LA/GA值，調(diào)節(jié)PLGA支架的性能。此外，本實(shí)驗(yàn)得到的PTX- PLGA膜片的降解速度略快于以往的報(bào)道[18]，分析原因可能為:首先，換液時(shí)降解液的沖刷會(huì)在一定程度上加速降解，而這更符合實(shí)際情況，因?yàn)橹苽涑傻闹Ъ芊湃胧彻芎髣?dòng)物的進(jìn)食會(huì)對(duì)支架產(chǎn)生一定的沖刷作用；其次，不同的制備方式以及材料的厚度也可能會(huì)影響PLGA的降解速率。

PTX作為一種傳統(tǒng)的抗組織增生藥物可搭載或直接涂覆于支架表面[19]，以抑制周圍環(huán)境中組織細(xì)胞分裂、增殖和遷移，從而抑制支架再狹窄[20]。近幾年，諸多研究者致力于探索載PTX的非血管生物可降解支架在治療良性狹窄方面的應(yīng)用。但是，對(duì)于治療良性食管狹窄的PTX藥物洗脫支架的載藥量以及藥物釋放劑量仍沒(méi)有一致性的研究意見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)制備的PTX- PLGA材料行體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)得了不同時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放量，并且用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)其初始載藥量達(dá)到20%時(shí)，細(xì)胞晚期凋亡率大于10%。這為將PLGA作為藥物釋放平臺(tái)的藥物釋放量以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的參考。

可降解聚合物材料相比傳統(tǒng)的聚合物材料，其力學(xué)性能相對(duì)較弱，在相同的結(jié)構(gòu)下可降解聚合物支架徑向支撐力比金屬支架的徑向強(qiáng)度小很多，并且其自膨性相對(duì)較差，甚至不能滿足臨床的要求[21]。本實(shí)驗(yàn)中我們嘗試將其裁剪成長(zhǎng)條狀并卷到模具上，干燥定型后制備成PLGA支架，但是由于高分子材料本身機(jī)械性能很差，無(wú)法達(dá)到局部支撐狹窄食管的要求。我們也嘗試以下幾種方法來(lái)解決其材料本身的不足：(1) 改變支架結(jié)構(gòu)，如增大PLGA密度或者厚度；(2) 改變材料性質(zhì)，混入添加劑來(lái)增加材料強(qiáng)度，本實(shí)驗(yàn)嘗試通過(guò)增加一些添加劑或者在PLGA材料上添加一些基團(tuán)以增強(qiáng)PLGA強(qiáng)度。雖然這些手段在一定程度上能有效增加支架的徑向支撐力，但這是以降低柔順行為為代價(jià)的，并且會(huì)對(duì)材料本身的降解性能以及支架軸向短縮率等造成較大的影響。此外，我們還嘗試將PLGA聯(lián)合可降解金屬，利用PLGA較好的生物兼容性的特點(diǎn)將其作為覆膜材料制備可降解復(fù)合支架。可降解金屬的韌性和強(qiáng)度較高[22]，能彌補(bǔ)高分子支架徑向強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)，將載有抗增殖藥物的PLGA覆在裸金屬支架的表面，PLGA不僅作為藥物的載體，而且其良好的生物兼容性可以減少對(duì)局部組織的刺激，從而降低不良反應(yīng)發(fā)生率。同時(shí)，高分子聚合物覆在可降解金屬表面可以有效延緩鎂合金的降解，延長(zhǎng)支架有效支撐時(shí)間。

總之，PLGA具有良好的生物兼容性，可有效減少因植入物的刺激而導(dǎo)致的局部組織增生，從而降低再狹窄率，并可以作為藥物釋放的載體在降解的過(guò)程中緩慢穩(wěn)定地釋放藥物，是制備生物可降解藥物洗脫支架的可選材料。