低溫常壓等離子體改善牙本質-全酸蝕粘接系統粘接效果的體外研究

王欽鴻 王丹楊 謝娜 唐成芳 李子夏 王路明

[摘要]目的：本研究擬觀測低溫常壓等離子體射流處理對牙本質-全酸蝕粘接系統粘接效果及牙本質膠原纖維耐NaClO降解的效果。方法：離體牙去除牙合面牙釉質，暴露的牙本質打磨后酸蝕15s并沖洗，隨后用NTAPP射流分別處理牙面0、5、10、15、20s，常規制作微拉伸粘接試件，每組有一半試件冷熱循環10 000次，分別檢測各組循環前后牙本質粘接強度。獲取中層牙本質片，酸蝕后經NTAPP處理0、5、10、15、20s后，分別浸泡于5% NaClO溶液中0、30、60、120s，掃描電鏡觀察各組脫礦牙本質膠原的降解情況。對各組粘接強度進行統計分析。結果：所有NTAPP處理組的微拉伸粘結強度（Micro-tensile bond strength，?TBS）值均顯著高于對照組;NTAPP處理5s組的?TBS值顯著高于其他組;老化后NTAPP處理5s和10s組的?TBS值顯著高于其他各組。掃描電鏡觀察脫礦膠原顯示，隨著NaClO溶液處理時間延長，各組牙本質膠原均呈現不同程度降解，對照組120s膠原完全消失，但NTAPP處理組仍可見膠原纖維殘留。NTAPP處理5和10s經NaClO浸泡30s后，膠原纖維網結構完整。NTAPP處理15和20s，使部分膠原纖維凝結變性。結論：采用合適的參數及處理時間，NTAPP可有效保護牙本質膠原纖維并提高牙本質-全酸蝕粘接界面的耐久性。

[關鍵詞]等離子體;牙本質;微拉伸粘接強度;粘接持久性;膠原;全酸蝕粘接劑

[中圖分類號]R783? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）07-0093-04

In Vitro Study of Non-thermal Atmospheric Pressure Plasma in Improving the Bonding Effect of Dentin with an Etch-and-rinse System

WANG Qin-hong1，WANG Dan-yang1，XIE Na2，TANG Cheng-fang1，LI Zi-xia2，WANG Lu-ming3

（1.Department of Prosthodontics;2.Department of Oral Medicine，School of Stomatology，Xian Medical University，Xian 710021，Shaanxi，China;3.Department of Stomatology，the Second Affiliated Hospital of Xian Medical University，Xian 710038，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To evaluate the bonding effect of non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on the dentin-adhesive interface with an etch-and-rinse system and the degradation resistance of collagen under the sodium hypochlorite （NaClO） challenge. Methods? The occlusal enamel of each tooth was removed. The exposed and polished dentin surface was etched for 15s and rinsed. The etched dentin surface was exposed to the plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s. Then the micro-tensile bonding specimens were made following the method described previously. Half of the specimens in each group were thermo-cycled 10 000 times. The micro-tensile bonding specimens from each tooth were subjected to μTBS testing. The dentin slabs of middle part from each tooth were treated with plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s after etched， and further immersed in 5% NaClO solution for different treatment times （0， 30， 60 and 120s）. All specimens were observed under FE-SEM. The results of μTBS were analyzed with SPSS. Results? The μTBS values of all NTAPP treatment groups were significantly increased compared with the control group. The T-5 group presented statistically higher μTBS values than any other groups. After thermocycling aging， the μTBS values of 5 and 10s groups were significantly higher than those of the other groups. Collagen fibrils presented with various levels of degradation in each group， with increasing NaClO treatment time. After NaClO treatment for 120s， the collagen fibrils of control group were completely degraded. However， residue collagen fibrils were still observed in the NTAPP treatment group. Collagen fibrils of 5 and 10s groups presented well-formed open networks after NaClO treatment for 30s. After NTAPP treatment for 15 and 20s， some demineralized collagen fibrils were melted and degenerated. Conclusion? Under optimal in vitro conditions， NTAPP treatment is effective in enhancing the dentin–bonding strength， improving the durability of the dentin–adhesive interface， and modifying the degradation resistance of collagen under NaClO challenge.

Keywords： non-thermal atmospheric pressure plasma; dentin; micro-tensile bond strength; bonding durability; collagen; the etch-and-rinse adhesive system

牙體組織與修復材料之間形成牢固且長效的粘接力對口腔粘接修復至關重要。牙本質的粘接依賴于混合層結構的形成[1]，但現有的全酸蝕粘接系統及自酸蝕粘接系統會在混合層底部形成缺陷帶及納米滲漏，使部分牙本質膠原失去粘接劑的保護作用而裸露，易受到水分以及各種蛋白水解酶的作用發生降解，引起牙本質粘接界面的退變[2-5]。因而，如何有效提高牙本質膠原纖維交聯度，減少膠原裸露，是改善牙本質粘接界面耐久性的主要手段。低溫常壓等離子體（Non-thermal atmospheric pressure plasma，NTAPP）是近年來一種新興的表面處理技術，可以產生大量帶電粒子、各種離子、自由基、活性氧等活性物質，并且在能量轉換時對周圍環境的加熱作用較弱，因此可保持較低溫度，使得等離子體技術可以應用于熱敏感性較高的生物組織[6]。已有研究表明[7]，NTAPP處理可以改變牙本質表面理化性能，提高牙本質即刻粘接強度。有學者推測NTAPP處理可使膠原纖維的二級結構發生改變[7]，但這種改變是否能夠增加膠原的交聯度提升其生物力學強度，從而改善牙本質粘接界面耐久性，目前尚不明確。本研究擬探討NTAPP處理牙本質后，對其粘接持久性、膠原耐降解性的影響，以期為NTAPP在口腔粘接領域的應用提供可靠的理論依據。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器：萬能材料試驗機（Shimadzu公司，日本），場發射掃描電鏡（field emission scanning electron microscope，FE-SEM，JSM-7500F，Jeol，日本），光固化機（Dentsply公司，美國），37℃水浴恒溫箱（上海方瑞儀器有限公司），低速金剛石切割機（沈陽科晶自動化設備制造有限公司），低溫常壓等離子體發生裝置（CTP-2000K，南京蘇曼等離子科技有限公司），示波器（MSO1104Z，蘇州普源精電科技有限公司），齒科冷熱循環機（西安世紀測控技術研究所）。

1.2 主要試劑和材料：Single Bond 2全酸蝕粘接劑、Filtek Z250復合樹脂（3M公司，美國），37%磷酸酸蝕劑（Vericom 公司，韓國），高純度氦氣（99.999%，西安天盛氣體有限公司），去離子水。

收集新鮮無齲的第三磨牙（西安醫學院第二附屬醫院口腔科），患者知情同意，刮除附著軟組織，清洗后生理鹽水中4℃保存，于1周內使用。本研究由西安醫學院倫理委員會審查通過，批準號為XYLS2020142，患者均簽署知情同意書。

1.3 微拉伸粘接強度測試

1.3.1 NTAPP射流產生：本研究使用的NTAPP設備采用連續正弦波驅動的介質阻擋放電原理，電源輸入功率為8W，峰值電壓Vpp為7.0kV，頻率為54.9kHz，放電氣體為高純度氦氣（He），氣體流量為4L/min。

1.3.2 牙本質微拉伸粘接試件的制備：60顆新鮮離體牙用慢速切割機在流水降溫條件下，暴露咬合面牙本質，600目碳化硅砂紙研磨60s，預備出統一的粘接面玷污層，超聲清洗5min。采用隨機數字表法，根據NTAPP處理時間的不同5、10、15、20s以及是否進行老化處理隨機分10組（n=6），以未預處理組作為陰性對照組。

牙本質表面用37%的磷酸凝膠酸蝕15s，流水沖洗60s，無塵紙巾吸干試件表面水分后置于NTAPP噴嘴下方3cm處，按照分組使NTAPP射流均勻噴刷牙面。使用無塵紙巾蘸取蒸餾水潤濕牙面15s，濕棉球蘸干多余水分，按照Single Bond 2說明書涂布兩遍粘接劑，進行常規樹脂粘接。將粘接試件浸入37℃蒸餾水中24h。

1.3.3 試件老化處理及微拉伸粘接強度測試：未老化組牙齒用慢速切割機于流水冷卻下順牙齒長軸、垂直于粘接界面片切，制備用于微拉伸粘接強度測試的條狀試樣（0.8mm×0.8mm×8.0mm）。粘接試件分別用502膠固定于測試臺上，用萬能測試機（精度為0.02N）以1.0mm/min的加載速度進行測試，直至試件斷裂，記錄粘接界面拉斷時的載荷，根據公式計算：微拉伸強度（MPa）=斷裂載荷（N）/試件截面積（mm2）。將來自同一顆牙的粘接試件的粘接強度求均值作為一獨立樣本，然后結合同一組內來自其他牙齒粘接試件的均值一起獲得每組的粘接強度均值與標準差。

老化組牙齒固定于冷熱循環試驗機上，在5℃和55℃環境中進行循環，每次停留60s，循環10 000次取出進行微拉伸測試，方法同前。

1.4 牙本質膠原耐次氯酸鈉溶解作用的檢測

1.4.1 試件制備：流水沖洗下，27顆新鮮離體牙用慢速切割機去除咬合面釉質層，截取冠部牙本質，每顆牙可制取3片1.5×1.5×6mm3大小的牙本質片，每個牙片背面刻兩道刻痕以區分試件正反面。80個試件隨機分為5組（n=16）。牙本質片正面酸蝕、NTAPP處理方式同1.3.2。隨后各組牙本質片分別浸泡于3.5ml 5%濃度的NaClO溶液中0、30、60、120s（n=4），然后流水下沖洗4h。

1.4.2 膠原顯微形貌觀察：將處理后的牙本質試件，用2.5%戊二醛0.1mol/L、pH7.2的PBS固定4h，PBS沖洗3次，乙醇梯度脫水，真空干燥、噴金，在FE-SEM下觀察脫礦牙本質膠原的超微結構。

1.5 統計學分析：采用SPSS 18.0統計軟件，采用K-S檢驗證實數據符合正態分布，對實驗數據進行Levene方差齊性檢驗后，對?TBS 進行雙因素方差分析（影響因素：等離子體處理、老化處理）。對同一老化條件下?TBS進行單因素方差分析，Tukey檢驗進行組間兩兩比較。對同組老化前后的?TBS進行獨立樣本t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2? 結果

2.1 微拉伸強度：各組?TBS結果見圖1。等離子體和老化處理均對粘接強度有顯著影響（P<0.001），且兩者間交互作用顯著（P<0.05）。老化前，各NTAPP處理組?TBS顯著高于對照組（P<0.05），以NTAPP處理5s組粘接強度最高（55.63±1.81）MPa。老化后，NTAPP處理5和10s組?TBS稍有降低，與老化前相比差異無統計學意義（P>0.05），并顯著高于其他各組（P<0.05）。老化后，對照組、NTAPP處理15、20s組?TBS顯著降低（P<0.05），但15、20s組粘接強度仍顯著高于對照組（P<0.05）。

2.2 NaClO溶解后各組膠原纖維形貌：由圖2可見，隨著NaClO處理時間延長，各組膠原纖維網均出現不同程度降解現象。對照組未經NaClO處理前，牙本質小管間、管周及小管內膠原纖維網完整（見圖2A）。經NaClO處理30s后，管周和小管內部膠原纖維網仍可保持完整性，但管間膠原纖維降解（見圖2B）。經NaClO處理60s后，膠原纖維降解現象加劇，僅某些小管內可見單根完整的膠原纖維（見圖2C）。經NaClO處理120s后，膠原纖維完全降解，牙本質小管口開放呈較大的漏斗狀，根管壁可見側支開口（見圖2D）。

NTAPP處理5、10s組經NaClO處理30s后，膠原纖維網形貌與未經NaClO處理的對照組相似，無明顯改變（見圖2E～F）。經NaClO處理60s后，管周和小管內膠原纖維網結構仍較完整（見圖2G）。經NaClO處理120s后，膠原纖維進一步降解，未降解的膠原纖維出現斷裂和卷曲現象（見圖2H）。

NTAPP處理15、20s組未經NaClO處理前，小管口上方可見片狀膠原凝集物（見圖2I）。經NaClO處理30、60s后，管內膠原纖維斷裂并顯著減少，小管口仍可見片狀膠原凝集物（見圖2J～K）。經NaClO處理120s后，僅可觀測到少量片狀膠原凝集物位于小管口上方（見圖2L）。

3? 討論

等離子體是繼氣體、液體和固體之后的第四種物質形態，是氣體在高頻高壓電場作用下，得到的一種呈電中性并具備高電離度的氣體團。包含帶電粒子、各種離子、自由基、活性氧、紫外線、可見光等大量活性物質[8-9]。由于氣體流溫度較高，應用受限。低溫常壓等離子體可保持較低溫，使得等離子體技術能夠應用于生物醫學領域。目前，NTAPP在口腔醫療領域的研究包括滅菌、修復材料表面改性、牙齒美白、牙周治療及口腔粘接技術[10-13]。其中，滅菌及材料改性受溫度影響較低，后三種研究方向因涉及到牙髓、細胞及膠原等生物組織，對NTAPP的溫度累積作用異常敏感，限制了NTAPP在該領域的應用研究，亟需探索適合的放電參數。

本研究的微拉伸粘接強度測試結果顯示，等離子體處理可以顯著提高牙本質與全酸蝕粘接系統的即刻粘接強度，并維持較穩定的粘接持久性，這與以往研究結果基本一致[7，14-15]。其具體機制與以下方面相關：①等離子體處理可以改善牙本質表面的親水性和潤濕性，降低牙本質表面接觸角，從而提高粘接劑在牙本質粘接界面的滲透性[13，16];②等離子體處理可以向膠原纖維引入羧基或羰基等官能團[7，14，17]，牙本質表面羰基含量的增加可提高膠原纖維與粘接劑之間氫鍵的相互作用;③羰基數目增加產生的電斥力使膠原纖維暫時脫聚成更小的纖維聚集體，甚至單個纖維，提高了粘接劑對膠原纖維的滲透[7];④等離子體的抗菌作用發揮一定功效[12]，牙體預備后殘留的細菌可在牙本質粘接界面存活兩年之久，經等離子體處理可降低粘接界面微生物介導的降解。

膠原耐降解結果顯示，對照組經NaClO浸泡后膠原纖維的降解程度較NTAPP處理組顯著，提示NTAPP處理可改善牙本質膠原纖維的強度，這可能與等離子體介導的交聯作用相關。等離子體產生的紫外線可引起明膠分子間交聯，并在膠原和明膠氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香殘基上形成自由基[18]。其次，等離子體產生的自由基可與OH相互作用，在聚合纖維上形成羥基化合物，隨后可通過氫鍵增加交聯數量[19]。此外，等離子體中的電子也與基質相互作用，在聚合物鏈中形成自由基，引發聚合鏈中瞬間形成自由基，進而啟動交聯過程[20]。

NTAPP處理具有雙重效用，在適宜的參數下，可有效增加牙本質粘接強度、持久性及膠原的機械強度，而處理牙本質時間過長會降低粘接強度，并改變脫礦牙本質的微觀形貌。脫礦的牙本質膠原纖維會在40℃左右發生變性[21-22]，NTAPP處理15和20s可見膠原凝結成片狀，提示這兩組的熱量累積破壞了脫礦的膠原纖維，NTAPP產生的高能粒子及氣體流量對脫礦膠原也存在一定影響。這兩組?TBS在老化前后的變化也印證了NTAPP的負面作用。

在適宜條件下，NTAPP處理可有效提高牙本質粘接強度，改善牙本質與全酸蝕粘接劑（Single Bond 2）的粘接持久性，增強脫礦膠原纖維耐NaClO溶解的能力。本研究中，最適宜的處理時間是5s。而NTAPP處理對牙本質膠原纖維交聯作用的具體機制仍需進一步實驗研究。

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[收稿日期]2021-01-26

本文引用格式：王欽鴻，王丹楊，謝娜，等.低溫常壓等離子體改善牙本質-全酸蝕粘接系統粘接效果的體外研究[J].中國美容醫學，2021，30（7）：93-97.