SD大鼠凝血四項檢查正常參考值范圍探討*

劉珍清 趙媛媛 任一冉 張美齡 劉 穎

(1.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 100029)(2. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488)

止血、抗凝等藥物的藥效評估以及新藥的安全性評價一般需要對凝血四項參數：凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(FIB)進行檢測，從而進一步監測止血和抗凝等藥物的療效、其可能作用的凝血通路以及新藥潛在的毒性反應等[1-2]。因此，凝血四項指標的可靠性與準確性將會對最終的實驗結果產生直接的影響。實驗室檢查中對PT、APTT、TT和FIB的檢測實際上是監測一系列酶促反應終點的過程，故從取材到最終指標檢測的整個過程中，大鼠的取血方式、血樣是否溶血、標本量、抗凝劑的品牌等眾多的因素皆會對實驗結果產生干擾[3-5]。目前，尚未見有關SD大鼠凝血四項檢查正常參考值范圍的報道。因此，建立本實驗室凝血四項檢查參考值范圍，對規范基礎藥理學研究和新藥研究具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雄性，體質量(190±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠在同一環境下適應性飼養3 d，溫度23～25 ℃，相對濕度55%～65%，實驗動物自由進食飲水，12 h/12 h明暗飼養。實驗開始前，動物禁食不禁水12 h。倫理審查編號：BUCM-4-2019041802-2090。

1.2 實驗儀器

Sysmex CA-550型全自動凝血分析儀(日本希森美康公司)；HC-2518R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.3 實驗試劑

質控液、定標液和凝血四項檢測試劑盒均購自希森美康生物科技(無錫)有限公司。凝血酶原時間測定試劑(凝固法)，批號：R8038；活化部分凝血活酶測定試劑(凝固法)，批號：R8034；凝血酶時間測定試劑(凝固法)，批號：48123；纖維蛋白原測定試劑(凝固法)，批號：R8043；緩沖液，批號：R6009；氯化鈣溶液，批號：R6010；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，批號：20180523；3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑(上海源葉生物科技有限公司)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)。

1.4 實驗方法

40只SD大鼠標號稱質量后，以水合氯醛(40 mg/kg)將大鼠麻醉后，于腹主動脈取血，并按照9∶1的比例與3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑混合均勻，以3 000 r/min離心15 min，取出上層血漿，利用全自動凝血分析儀檢測PT、APTT、TT和FIB四項指標，檢測需要在2 h之內完成。

1.5 數據分析

2 結果

SD大鼠凝血四項的檢測結果見表1所列。

表1 SD大鼠PT、APTT、TT和FIB測定結果

3 討論

凝血四項檢查不但是臨床用于凝血功能初篩的參數，同時也是實驗室中止血和凝血等相關藥物研究和安全性評價的重要指標[5]。隨著分子生物學、免疫學等學科的快速發展，凝血四項檢查已經不單單應用于出血或者凝血等疾病的診斷范疇，對肝炎、肝硬化、妊娠高血壓等多種疾病的診斷也具有很大的臨床價值[6-9]。凝血四項參數中的PT既可以反映機體的外源性凝血通路，包括凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ和Ⅱ的含量及其活性，也可以用來監測彌漫性血管內凝血和肝臟蛋白質合成成功與否。本研究采用凝固法，通過向待測血漿中加入氯化鈣和組織因子來觀察其凝固需要的時間從而獲取SD大鼠的正常PT值范圍。APTT可以初步反映機體的內源性凝血通路和篩查凝血因子(Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)是否缺乏，還可用于狼瘡抗凝物、監測肝素抗凝治療等的監測[10]，是當前抗凝藥物檢查的重要指標。TT既是低(或無)FIB血癥以及異常纖維蛋白血癥等FIB減少的指標，同時也可以用于衡量纖維蛋白(原)降解產物是否增高。臨床上多用于肝素治療檢測，也用于活血化瘀藥物、止血藥物[11-12]等藥效的檢測。另外，FIB作為肝臟合成的凝血因子，是血凝塊能夠穩定形成的重要結構組成，在血漿中的含量最高[13]。在機體大量出血時，FIB最先消耗并最早達到凝血因子的臨界值，由此可見該指標在探討藥物止血或者凝血作用的重要性。

SD大鼠具有穩定性較好、價格便宜等優點，是目前研究止血或凝血藥物對凝血四項影響的常用實驗動物。謝珍等[14]對不同采血方式對SD大鼠的凝血四項參數指標影響進行了考察，結果顯示腹主動脈采血得到的血樣的PT、APTT、TT及FIB指標的穩定性好，動物之間數據沒有統計學差異。何佩恒等[15]研究不同取血方式對Wistar大鼠的血液學指標的影響，從而得出腹主動脈取血所獲取的血樣的各項血常規指標之間無統計學差異。另外，利用真空管和采血針對SD大鼠腹主動脈取血速度快，且在采血過程中受到的干擾因素少，樣品的成分以及性質較為穩定，因此本研究中所檢測的血樣皆通過腹主動脈取血獲得。除此之外，已有文獻研究EDTA-K2抗凝劑中的EDTA可以干擾或者抑制纖維蛋白凝塊形成時的纖維蛋白單體的聚合；草酸鈉抗凝劑可以與血中的Ca2+生成不溶性的草酸鈣沉淀，與這兩種抗凝劑相比，枸櫞酸鈉抗凝劑因其具有保護凝血因子等優勢成為檢測凝血四項的理想抗凝劑。在本研究中，參照文獻中常用的抗凝濃度，利用3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑作為SD大鼠的抗凝劑。

綜上，在血液樣本的PT、APTT、FIB和TT的檢測過程中，血漿存放的時間、抗凝劑的種類、取血方式、血液質量以及分析系統[16]等因素均會影響凝血四項的檢測值。因此，本實驗室在固定樣本前處理方法的情況下，建立了本室的正常SD大鼠的凝血四項參考值范圍，其結果與文獻記錄一致[17-19]。該范圍的建立加強了實驗室檢查和管理的質量控制，并為后續藥理實驗的順利開展提供了參考。