不同干預(yù)方式對ASD大鼠認(rèn)知能力的影響及機(jī)制探討*

魏渼淇 劉忠民 馮廣智

(1.廣西幼兒師范高等專科學(xué)校，南寧 530000)(2.海南科技職業(yè)大學(xué)，海口 570000)

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)，也稱孤獨(dú)性障礙(autistic disorder)，是包括了典型孤獨(dú)癥、自閉癥及其他社交功能障礙疾病的一種先天疾患。近幾十年來，我國自閉癥患兒數(shù)量日益增多，自閉癥致殘率的居高不下[1]，給患兒家庭和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，改善自閉癥的核心癥狀的研究顯得十分迫切，因此許多研究者在積極尋找ASD的病因與治療方法。體育運(yùn)動(dòng)干預(yù)作為一種便捷、有效的自閉癥康復(fù)手段，近年來受到越來越多的重視。崔碧玉[2]研究證實(shí)運(yùn)動(dòng)健身活動(dòng)干預(yù)對孤獨(dú)癥兒童具有正面的促進(jìn)作用；張嵐[3]研究證實(shí)體育運(yùn)動(dòng)和游戲相結(jié)合的康復(fù)訓(xùn)練能夠提高ASD患兒的社交能力、耐力和運(yùn)動(dòng)能力。豐富環(huán)境[4]已證實(shí)可通過增強(qiáng)腦結(jié)構(gòu)及功能可塑性進(jìn)而改善個(gè)體的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知行為。周潔[5]研究顯示豐富環(huán)境可逆轉(zhuǎn)丙戌酸鈉(VPA)誘導(dǎo)的ASD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能異常。有氧運(yùn)動(dòng)可改善自閉癥模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，顯著提高PSD-95(postsynaptic density protein 95，PSD95)在大鼠海馬的表達(dá)水平，但其機(jī)制并不明確。PSD-95作為一種功能橋蛋白可將NRXN-NLGN-SHANK通路串連，此信號(hào)通路調(diào)控突觸形成、傳遞、可塑性和成熟，其異常可能導(dǎo)致ASD發(fā)病[6]。本研究觀察有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及二者結(jié)合對ASD模型鼠認(rèn)知能力的影響，并進(jìn)一步選擇與NRXN-NLGN-SHANK信號(hào)通路緊密相關(guān)的ASD易感基因NRXN1、NL3以及Shank3在大鼠海馬組織的表達(dá)情況作為觀察目標(biāo)，以期為有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及兩者結(jié)合治療自閉癥提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為基因通路治療自閉癥提供新的治療策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，雌性大鼠體質(zhì)量175～225 g，雄性大鼠體質(zhì)量300～350 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2016-0001，生產(chǎn)子代仔鼠(不限雌雄)共110只，實(shí)驗(yàn)用50只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場所：吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(吉)2018-0001。福利倫理審查編號(hào)：20190509。

1.2 主要試劑和儀器

VPA(碧云天生物科技有限公司)；二甲基亞砜(Biological Industries)；臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞染料(北京鼎國生物有限公司)；細(xì)胞裂解液(BD)；胎牛血清(Corning)；兔抗小鼠NRXN1和兔抗小鼠NL3(Thermo Fisher Scientific)；Shank3多克隆抗體(艾美捷科技有限公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(北京全式金生物科技有限責(zé)任公司)；磷酸鹽緩沖液和RNase-Free water(Sigma)。紅外曠場實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與Smart3.0全新行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)(東樂自然基因生命科學(xué)公司)Morris水迷宮(安徽淮化正華生物儀器設(shè)備有限公司)；高速大容量離心機(jī)(BECKMAN)；EthoVisionXT運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(贊德儀器有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)。

1.3 動(dòng)物模型的建立及分組

選取健康成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)一周。適應(yīng)環(huán)境后，1∶1合籠過夜，次日將檢查到陰栓的雌鼠換籠，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。以見陰栓當(dāng)日為懷孕第一天，記E1(embryonic day)。將16只受孕雌鼠隨機(jī)分為兩組，一組為模型組，另一組為對照組。模型組參照Schneider等[7]的建模方法，E12.5時(shí)對該組孕鼠按600 mg/kg腹腔注射250 mg/mL VPA，模型組子代仔鼠合計(jì)52只，其中經(jīng)行為學(xué)檢測成功可作為ASD模型鼠的48只，成模率92.3%。挑選40只運(yùn)動(dòng)ASD模型鼠，分為有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組、有氧+環(huán)境組以及ASD模型組，每組10只。對照組的孕鼠常規(guī)飼養(yǎng)，子代仔鼠合計(jì)58只，在其子代隨機(jī)挑選10只作為空白對照組。

1.4 干預(yù)前行為學(xué)檢測

仔鼠出生一周后，進(jìn)行ASD樣行為學(xué)檢測，與空白對照組相比，篩選出具有明顯自閉癥樣行為的小鼠為ASD模型鼠。仔鼠出生當(dāng)日為產(chǎn)后第1天，記PN1(postnatal day，PN)。

1.4.1方向趨向檢測：于PN7～PN10對仔鼠進(jìn)行檢測，將仔鼠頭朝向下方置于傾斜角度25°的光滑斜板上，記錄其轉(zhuǎn)身角度180所需時(shí)間。

1.4.2游泳行為實(shí)驗(yàn)：于PN8、PN10、PN12和PN15將各組仔鼠依次單獨(dú)放入28 ℃的恒溫水槽，觀察5～10 s，對其游泳能力進(jìn)行評分并記錄。評分標(biāo)準(zhǔn)：耳朵超過水位線，4分；水位線在耳朵中間，3分；鼻子超過或與水位線平齊，2分；鼻子在水位線下，1分。

1.5 干預(yù)方法

有氧運(yùn)動(dòng)組：于PN31開始接受有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，持續(xù)8周，6次/周；每次在同一時(shí)間段，持續(xù)90 min的游泳運(yùn)動(dòng)；豐富環(huán)境組：于PN31飼養(yǎng)于內(nèi)有各種玩具，可供大鼠嬉戲、玩耍及社交的豐富環(huán)境飼養(yǎng)籠中；有氧+環(huán)境組：于PN31接受運(yùn)動(dòng)干預(yù)，同時(shí)在豐富環(huán)境中飼養(yǎng)；空白對照組和ASD模型組：常規(guī)飼養(yǎng)，不予干預(yù)。

1.6 干預(yù)后行為學(xué)檢測

干預(yù)后，采用曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察其行為學(xué)表現(xiàn)。

1.6.1曠場實(shí)驗(yàn)：在40 cm的測試盒中進(jìn)行，觀察其行為學(xué)表現(xiàn)，曠場分為4場，共16個(gè)方格，中間的4個(gè)為中央?yún)^(qū)域，其余12個(gè)為周圍區(qū)域。將大鼠分組放置中間區(qū)域開始實(shí)驗(yàn)，使用紅外曠場實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測5 min，使用Smart 3.0行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)穿格次數(shù)。

1.6.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)圓柱形水桶，直徑140 cm×50 cm及一個(gè)站臺(tái)，直徑為7 cm。以桶兩條互相垂直的直徑將水池分為4個(gè)象限，以不同顏色的阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記4個(gè)象限，將數(shù)字貼于水桶周圍。將水溫保持20～22 ℃，水深調(diào)節(jié)至40 cm，將站臺(tái)放置在第二象限中心且低于水面1 ～2 cm處。實(shí)驗(yàn)前5 d為定向航行階段，此階段每天進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次每只大鼠從不同象限進(jìn)入水池。訓(xùn)練內(nèi)容是將做好標(biāo)記的大鼠從4個(gè)象限邊緣中心點(diǎn)、面向水池壁輕放入水池，讓其自主尋找平臺(tái)，60 s內(nèi)找到平臺(tái)的大鼠逃避潛伏期記為找到平臺(tái)所用時(shí)間；60 s內(nèi)未找到平臺(tái)的大鼠，用一根小木棍引導(dǎo)該大鼠至平臺(tái)上停留，停留10 s，記該鼠潛伏期為60 s。訓(xùn)練結(jié)束后撤去平臺(tái)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠面向水池壁放入水池，進(jìn)行巡航，采用EthoVisionXT運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠60 s探索水池軌跡，分析大鼠在原平臺(tái)所在象限時(shí)間。

1.7 樣本采集和處理

斷頸處死大鼠，從枕骨大孔處打開顱腔，完整取出大腦，根據(jù)大鼠腦立體定位冰上剝離兩側(cè)海馬，置于凍存管中，經(jīng)液氮速凍后取出，保存于-80 ℃冰箱。

1.8 Western blot檢測大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達(dá)水平

1.8.1總蛋白的提取：稱取凍存的海馬組織置入勻漿器，PBS沖洗后加入蛋白質(zhì)裂解液，冰浴同時(shí)研磨勻漿，裂解0.5 h后，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。移液管吸取上清層至新EP管，-20 ℃保存。

1.8.2檢測樣品蛋白含量：BCA法測定。

1.8.3電泳：配制電泳所需的分離膠與濃縮膠，加入TEMED后灌膠，完成后用水沖洗，放入電泳槽。加樣，每條泳道蛋白樣品上樣量為20 μg，緩慢操作避免污染。電泳時(shí)，恒流200 mA電流轉(zhuǎn)膜，1.5 h。

1.8.4封閉： 蛋白膜取出后TBS漂洗2 min，TBST室溫條件下封閉1 h。

1.8.5抗體孵育：切蛋白條帶后， 加入TBST稀釋后的一抗緩沖液(NRXN1、NL3和Shank3抗體，1∶3 000；β-actin抗體，1∶3 000)，封口后，4 ℃孵育過夜。

1.8.6二抗孵育：TBST中洗滌5 min，共洗3次，加入二抗緩沖液，4 ℃在側(cè)擺搖床孵育1 h(600 r/min)后取出，放入TBST洗滌，洗膜3次，每次10 min。

1.8.7圖像分析：顯色后，使用Image Lab系統(tǒng)進(jìn)行圖象掃描和結(jié)果分析。

1.9 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3的mRNA表達(dá)水平

取各組大鼠海馬組織樣本，采用RT-PCR檢測大鼠海馬組織中ASD易感基因NL3、NRXN1和Shank3的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)總RNA小量制備試劑盒的步驟提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA按擴(kuò)增流程進(jìn)行擴(kuò)增，在電腦上收集數(shù)據(jù)的程序是StepOne Software v.2.2.2，在每一個(gè)循環(huán)中，延伸結(jié)束后收集熒光。擴(kuò)增曲線中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。根據(jù)擴(kuò)增曲線得出每個(gè)樣品的Ct值(threshold cycle，Ct值)，由此算出基因的相對表達(dá)量(管家基因/參照基因：GAPDH)。引物序列見表1所列。

表1 被測基因引物序列表

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠穿格次數(shù)比較

穿格次數(shù)：空白對照組>有氧+環(huán)境組>有氧運(yùn)動(dòng)組>豐富環(huán)境組>ASD模型組。與空白對照組相比，有氧+環(huán)境組大鼠穿格次數(shù)較少，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組及ASD模型組的穿格次數(shù)較少且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中ASD模型組差異顯著(P<0.01)；與ASD模型組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組及有氧+環(huán)境組的穿格次數(shù)明顯增加(P<0.05)；有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組及有氧+環(huán)境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)。見表2所列。

表2 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)穿格次數(shù)的比較

2.2 各組大鼠逃避潛伏期比較

較ASD模型組，有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組和有氧+環(huán)境組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；較空白對照組，其余各組逃避潛伏期延長(P<0.05，P<0.01)；有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組和有氧+環(huán)境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見表3所列。

表3 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.3 各組大鼠原平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間比較

原平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間：空白對照組>有氧+環(huán)境組>有氧運(yùn)動(dòng)組>豐富環(huán)境組>ASD模型組。相較于空白對照組相比，有氧組及有氧+環(huán)境組大鼠穿原平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間較短，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，豐富環(huán)境組及ASD模型組的原平臺(tái)所在象限活動(dòng)時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；相較于ASD 模型組，其余4組大鼠在原平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間延長(P<0.05);有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境組、有氧+環(huán)境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表4所列。

表4 各組大鼠原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間比較

2.4 各組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較，ASD模型組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；干預(yù)后，與ASD模型組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境和有氧+環(huán)境組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，如圖1～圖4所示。

圖1 各組小鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 各組小鼠海馬組織中NRXN1蛋白表達(dá)水平

圖3 各組小鼠海馬組織中NL3蛋白表達(dá)水平

圖4 各組小鼠海馬組織中Shank3蛋白表達(dá)水平

2.5 各組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3 mRNA表達(dá)水平

與空白對照組比較，ASD模型組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；干預(yù)后，與ASD模型組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組、豐富環(huán)境和有氧+環(huán)境組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。如圖5～圖7所示。

圖5 各組小鼠海馬組織中NL3 mRNA表達(dá)水平

圖6 各組小鼠海馬組織中NRXN1的mRNA表達(dá)水平

圖7 各組小鼠海馬組織中Shank3的mRNA表達(dá)水平

3 討論

本研究以VPA誘導(dǎo)的ASD模型鼠作為研究對象，此類模型在國內(nèi)外針對自閉癥譜系障礙的相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用[8]，具有建模方法易操作、發(fā)病機(jī)制與人體患自閉癥譜系障礙機(jī)制相似[9]的優(yōu)點(diǎn)；選取有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境刺激及二者結(jié)合作為干預(yù)手段，選取有氧運(yùn)動(dòng)作為干預(yù)手段是因?yàn)榇罅垦芯拷Y(jié)果顯示適量有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)認(rèn)知控制力發(fā)展、促進(jìn)大腦認(rèn)知健康[10]，體育運(yùn)動(dòng)干預(yù)作為一種便捷的自閉癥康復(fù)手段，不僅可以調(diào)節(jié)自閉癥患者的身體，還能有效地提高自閉癥患者的自信心，讓自閉癥患者更好地融入社會(huì)[11]，而目前國內(nèi)針對運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善自閉癥患兒相關(guān)癥狀的研究[12]較為少見，其具體干預(yù)效果與機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果證明游泳運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及二者結(jié)合可以顯著提高PSD-95在自閉癥大鼠海馬的表達(dá)水平，PSD-95作為功能橋蛋白可將NRXN-NLGN-SHANK間相互連接起來，主要參與調(diào)節(jié)NRXN-NLGN-SHANK信號(hào)通路。有研究顯示，自閉癥大鼠海馬NL3蛋白表達(dá)與抑制性突觸傳遞能力呈負(fù)相關(guān)[13]，PSD-95的表達(dá)則會(huì)抑制因NL3蛋白誘導(dǎo)造成的抑制性突觸的變化，當(dāng)PSD-95與NL3共同表達(dá)則可平衡興奮性突觸與抑制性突觸。與NL3相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路(NRXN-NLGN-SHANK)[14]的興奮，緩解了相關(guān)突觸的興奮性與抑制性的失衡，影響海馬區(qū)突觸可塑性，并表現(xiàn)為認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力的提高。NL3可與突觸前膜的NRXN相互作用，還可與突觸后Shank蛋白結(jié)合。其中，Shank3高表達(dá)于海馬，其主要作用是促進(jìn)樹突棘形成、成熟，是形成功能性突觸的必要基因。NRXN主要與突觸的發(fā)生與發(fā)育、興奮-抑制性突觸的比例以及功能有關(guān)。自閉癥譜系障礙患者普遍存在NRXN1錯(cuò)義突變。

本研究結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及二者結(jié)合都可使ASD模型鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白的mRNA表達(dá)上調(diào)，NRXN1、NL3和Shank3均處于NRXN-NLGN-SHANK信號(hào)通路中，且均為自閉癥的易感基因。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及二者結(jié)合干預(yù)的ASD模型鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力、探究行為能力、空間記憶能力、空間學(xué)習(xí)能力等認(rèn)知能力均有所提高，其自閉癥核心癥狀，如社交障礙、重復(fù)刻板行為有明顯改善，這可能與有氧運(yùn)動(dòng)、豐富環(huán)境及二者結(jié)合干預(yù)引發(fā)NRXN-NLGN-SHANK通路主要基因NRXN1、NL3和Shank3的變化，促進(jìn)NRXN-NLGN-SHANK通路興奮，矯正突觸中興奮和抑制電流不平衡，從而促進(jìn)突觸的形成及發(fā)育有關(guān)。

自閉癥的致病機(jī)制復(fù)雜多樣，本研究為有氧運(yùn)動(dòng)、環(huán)境刺激及二者結(jié)合治療自閉癥提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研發(fā)可改善自閉癥核心癥狀的干預(yù)手段提供思路，為基因通路治療自閉癥提供了新的治療策略，為“體醫(yī)結(jié)合”提供新的推進(jìn)思路。