高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶工藝研究

黃華學(xué) 何安樂 劉庚貴 黃俊 熊瑤

【關(guān)鍵詞】甜菊糖;高純度;低溫;分步結(jié)晶

【中圖分類號(hào)】TS202.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2021）07-0049-03

0 引言

甜菊糖苷是從菊科草本植物甜葉菊中提取的極甜的非糖類物質(zhì)，它的甜度可達(dá)蔗糖的250～450倍，而熱量只有蔗糖的1/300且口感非常接近蔗糖，是經(jīng)我國衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)，繼甘蔗、甜菜糖之外的第三種極具開發(fā)價(jià)值和保健功能的天然甜味劑，被國際上譽(yù)為“世界第三糖源”。目前，甜菊糖苷的純化工藝主要采用重結(jié)晶法，需要使用大量有機(jī)溶劑（甲醇和乙醇），由于結(jié)晶母液中甜菊糖苷純度低（10%～20%），現(xiàn)有技術(shù)無法得到高純度甜菊糖苷（98%），導(dǎo)致大量高含量產(chǎn)品收率低，造成資源的大量浪費(fèi)和環(huán)境的嚴(yán)重污染，所以不適合工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)[1]。本研究采用分布結(jié)晶技術(shù)，以含量為80%的甜菊糖苷為原料，制備含量不低于99%的高純度甜菊糖苷產(chǎn)品，并獲得最佳工藝參數(shù)，從而為高純度甜菊糖苷產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料

（1）原材料：甜菊糖苷（總苷80%，江西海富生物工程有限公司生產(chǎn)）。

（2）試劑：甜菊糖苷（≥99.0%）AR、無水乙醇AR、無水甲醇AR、氫氧化鈉AR、磷酸AR、乙腈AR等。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)為Waters 2695）、恒溫水浴鍋（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、分析天平（“日本島津”生產(chǎn)）等。

2 方法

2.1 甜菊糖苷含量測定方法

甜菊糖苷含量的測定依照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 8270—2014》附錄A.4中規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

2.2 工藝路線

（1）溶劑的配置：將一定量的有機(jī)醇溶劑與純水按照一定的比例混合后，封閉待用。

（2）溶解：將100 g甜菊糖苷與溶劑按照一定的比例進(jìn)行混合，然后將其加熱至80 ℃進(jìn)行回流攪拌，直至全部溶解。

（3）常溫結(jié)晶：將溶解后的待結(jié)晶溶液置于常溫條件下24 h后進(jìn)行抽濾，并用95%的有機(jī)溶劑洗滌濾餅，收集濾餅并干燥稱重得甜菊糖苷T1。

（4）低溫結(jié)晶：將上述濾液置于低溫條件下，靜置24 h后，保持低溫快速抽濾，并用低溫的有機(jī)溶劑洗滌濾餅，收集濾餅并干燥稱重得甜菊糖苷T2。

（5）冷凍結(jié)晶：將上述濾液置于冷凍溫度條件下，靜置24 h后，保持低溫快速抽濾，并用冷凍溫度的有機(jī)溶劑洗滌濾餅，收集濾餅并干燥稱重得甜菊糖苷T3。

（6）母液回收：將上述得到的母液濃縮、干燥后稱重，即得甜菊糖苷T4。

（7）合并：將上述得到的3個(gè)結(jié)晶甜菊糖苷產(chǎn)品（T1、T2、T3）合并、稱重、檢測，即得高含量甜菊糖苷。

工藝路線如圖1所示。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Office 2020軟件，數(shù)據(jù)分析處理采用SPSS 8.0軟件。

2.4 低溫分步結(jié)晶工藝優(yōu)化方法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之，以乙醇濃度（A）、甜菊糖苷濃度（B）、常溫（C）、低溫（D）及冷凍（E）5個(gè)因素4個(gè)水平做多指標(biāo)正交試驗(yàn)表L16（45）進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)結(jié)晶制得甜菊糖苷重量及含量進(jìn)行綜合評(píng)分[2-3]。正交試驗(yàn)因素水平表見表1，多指標(biāo)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)乙醇濃度（A）、甜菊糖苷濃度（B）、常溫（C）、低溫（D）及冷凍（E）5個(gè)單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)并針對(duì)所得甜菊糖苷重量和含量2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察和分析，同時(shí)進(jìn)行方差分析，從而確定高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶的最佳工藝參數(shù)和影響主次因素的順序，其重量和含量結(jié)果見表2。

針對(duì)制得高純度甜菊糖苷產(chǎn)品的重量情況來看，由表1可以看出，高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶的最佳工藝參數(shù)為A2B2C4D4E2或A3B2C4D4E2，即乙醇濃度（A）為80%或85%、濃度（B）為30%、常溫（C）為30 ℃、低溫（D）為5 ℃及冷凍（E）為-25 ℃。5個(gè)因素對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶影響的主次因素為C>A>B>D>E。說明常溫結(jié)晶溫度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶制得的產(chǎn)品質(zhì)量影響最大，其次是乙醇濃度，再次是甜菊糖苷濃度，最后分別是低溫結(jié)晶溫度和冷凍結(jié)晶溫度。

針對(duì)制得高純度甜菊糖苷產(chǎn)品的含量來看，高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶的最佳工藝參數(shù)為A1B1C2D2E1，即乙醇濃度（A）為75%、濃度（B）為20%、常溫（C）為20 ℃、低溫（D）為-5 ℃及冷凍（E）為-30 ℃（見表1）。5個(gè)因素對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶影響的主次因素順序?yàn)锽>C>D>E>A。說明甜菊糖苷濃度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶制得的產(chǎn)品質(zhì)量影響最大，其次是常溫結(jié)晶溫度，再次是低溫結(jié)晶溫度，最后分別是冷凍結(jié)晶溫度和乙醇濃度。

乙醇濃度對(duì)各指標(biāo)的影響：從表3可以看出，乙醇濃度對(duì)含量的極差是最小的，也就是說，乙醇濃度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品的含量影響最小。乙醇濃度對(duì)產(chǎn)品重量的影響較大且A2和A3等同，由于高濃度乙醇成本較高，所以綜合考慮方案A2和A3，選擇最佳方案為A2，即乙醇濃度為80%。

甜菊糖苷濃度對(duì)各指標(biāo)的影響：從表3可以看出，甜菊糖苷濃度對(duì)含量的極差是最大，對(duì)產(chǎn)品重量影響適中，所以針對(duì)該研究是為了獲得高純度甜菊糖苷產(chǎn)品而言，優(yōu)先考慮獲得高純度，即選對(duì)含量影響最大的因素，選擇最佳方案為B1，即甜菊糖苷的濃度為20%。

常溫結(jié)晶對(duì)各指標(biāo)的影響：從表3可以看出，常溫結(jié)晶對(duì)重量的極差都是最大，即影響最大，同時(shí)常溫結(jié)晶對(duì)含量的影響也極大，也就是說，常溫結(jié)晶對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品重量和含量的影響都最大或較大，所以針對(duì)該研究是為了獲得高純度甜菊糖苷產(chǎn)品而言，優(yōu)先考慮獲得高純度，即選對(duì)含量影響最大的因素，選擇最佳方案為C2，即常溫結(jié)晶溫度為20 ℃。

低溫結(jié)晶各指標(biāo)的影響：從表3可以看出，低溫結(jié)晶對(duì)重量與含量的極差都是較小的，即影響較小，也就是說，低溫結(jié)晶的溫度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品影響較小，綜合考慮后，選擇最佳方案為D3，即低溫結(jié)晶溫度為0 ℃。

冷凍結(jié)晶各指標(biāo)的影響：從表3可以看出，冷凍結(jié)晶對(duì)重量與含量的極差是較小，即影響較小，也就是說，冷凍結(jié)晶的溫度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品影響較小，從節(jié)能的角度分析，綜合考慮后，選擇最佳方案為E2，即冷凍結(jié)晶溫度為-25 ℃。

通過對(duì)各因素對(duì)兩個(gè)指標(biāo)影響的綜合分析，得到理論上的最佳工藝參數(shù)為A2B1C2D3E2，即乙醇濃度為80%、甜菊糖苷濃度為20%。常溫結(jié)晶溫度為20 ℃、低溫結(jié)晶溫度為0 ℃、冷凍結(jié)晶溫度為-25 ℃。

3.2 方差分析

為了判斷以上5種受控因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響情況，將多指標(biāo)正交表進(jìn)行方差分析，找出其影響質(zhì)量和含量的主要來源。正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果見表4。

由表4的方差分析可以看出：C因素對(duì)產(chǎn)品重量的影響極其顯著性，A因素對(duì)產(chǎn)品重量的影響顯著，B因素對(duì)產(chǎn)品含量的影響顯著，而D和E對(duì)含量和重量的影響都不顯著。

綜上所述，說明常溫結(jié)晶溫度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品的重量具有極其顯著的影響，乙醇濃度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品的重量具有顯著的影響，甜菊糖苷濃度對(duì)高純度甜菊糖苷分步結(jié)晶所得產(chǎn)品的含量具有顯著的影響，低溫結(jié)晶溫度和冷凍結(jié)晶溫度對(duì)制得的產(chǎn)品重量與含量影響不顯著。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳工藝參數(shù)為A2B1C2D3E2，即乙醇濃度為80%、甜菊糖苷的濃度為20%、常溫結(jié)晶溫度為20 ℃、低溫結(jié)晶溫度為0 ℃、冷凍結(jié)晶溫度為-25 ℃。重復(fù)試驗(yàn)，并進(jìn)行質(zhì)量和含量的測定，得到重量為70.3 g、含量為99.5%的高純度甜菊糖苷產(chǎn)品，與理論值預(yù)期相符，高純度甜菊糖苷收率達(dá)87.4%，符合產(chǎn)業(yè)化需求。

4 結(jié)論與建議

4.1 結(jié)論

（1）高純度甜菊糖苷分布結(jié)晶的最佳工藝參數(shù)如下：乙醇的濃度為80%、甜菊糖苷的濃度為20%、常溫結(jié)晶溫度為20 ℃、低溫結(jié)晶溫度為0℃、冷凍結(jié)晶溫度為-25 ℃。

（2）得到重量為70.3 g、含量為99.5%的高純度甜菊糖苷產(chǎn)品，與理論值預(yù)期相符，高純度甜菊糖苷收率達(dá)87.4%，符合產(chǎn)業(yè)化需求。

（3）常溫結(jié)晶溫度對(duì)高純度甜菊糖苷重量具有顯著的影響，乙醇濃度對(duì)高純度甜菊糖苷重量具有顯著的影響，甜菊糖苷濃度對(duì)高純度甜菊糖苷含量具有顯著的影響，低溫結(jié)晶溫度和冷凍結(jié)晶溫度對(duì)制得的產(chǎn)品重量與含量影響不顯著。

4.2 建議

（1）在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，考慮使用乙醇作為有機(jī)溶劑，但未針對(duì)結(jié)晶所用的有機(jī)溶劑進(jìn)行研究，例如甲醇、正丁醇或是各種有機(jī)醇的混合物，后續(xù)試驗(yàn)可以考慮將其他有機(jī)溶劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得收率和含量更高且更易產(chǎn)業(yè)化的工藝。

（2）本試驗(yàn)中在分布結(jié)晶的過程中只考慮溫度對(duì)結(jié)晶的影響，沒有考慮每次分離之后所得母液有機(jī)溶劑濃度對(duì)結(jié)晶的影響，通過調(diào)整母液中有機(jī)溶劑的濃度，極有可能進(jìn)一步提升含量和收率。

（3）本試驗(yàn)設(shè)計(jì)只針對(duì)質(zhì)量和含量進(jìn)行考察，未對(duì)甜菊糖苷產(chǎn)品的食品感官進(jìn)行評(píng)定。甜菊糖苷為食品甜味劑，其口感滋味極為重要，口感不佳的產(chǎn)品很難有好的市場價(jià)值，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)該進(jìn)行重點(diǎn)考察純化過程對(duì)口感滋味的影響。

（4）本試驗(yàn)考察的是甜菊糖苷總苷的含量，分布結(jié)晶對(duì)各種單獨(dú)皂苷成分的影響情況沒有考察，下一步試驗(yàn)可以針對(duì)此影響開展研究。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]額爾敦巴雅爾，云雪艷，王琦銘，等.甜菊糖結(jié)晶過程中化學(xué)成分的分布及其總糖含量變化研究[J].中國食品添加劑，2020，31（11）：10-19.

[2]何安樂，江玉姬，謝寶貴.靈芝多糖酶解-Sevage法聯(lián)合脫蛋白工藝研究[J].中國食品工藝，2012（3）：54-58.

[3]劉庚貴，唐克軍，羅習(xí)，等.利用“廣西甜茶”生產(chǎn)≥98%甜茶苷的新工藝[J].企業(yè)科技與發(fā)展，2014（4）：11-12.