HPLC測(cè)定小兒清熱止咳口服液中苯甲酸的含量

尕藏卓瑪 楊麗瓊 達(dá)娃卓瑪

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏 拉薩 850000

小兒清熱止咳口服液原方來(lái)自我國(guó)漢代名醫(yī)張仲景的《傷寒雜病論》的麻杏石甘湯。麻杏石甘為麻黃、苦杏仁、石膏、甘草。本品現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》(2015年版)一部，具有清熱宣肺、平喘、利咽的功效，用于小兒外感風(fēng)熱所致的感冒，癥見(jiàn)發(fā)熱惡寒、咳嗽痰黃、氣促喘息、口干音啞、咽喉腫痛。該方由麻黃、炒苦杏仁、石膏、甘草、黃芩、板藍(lán)根、北豆根七味藥組成，輔料為蜂蜜、蔗糖、苯甲酸鈉[1]。已發(fā)表的文獻(xiàn)主要報(bào)道了該制劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芩苷及總黃酮的含量[2-5]。關(guān)于小兒清熱止咳顆粒中輔料苯甲酸的質(zhì)量控制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。苯甲酸又稱(chēng)安息香酸，適量的苯甲酸防腐劑能抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，延長(zhǎng)藥品的保存期[6-7]。但過(guò)量的苯甲酸會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生極大危害，對(duì)胃、皮膚和粘膜有一定的刺激性，對(duì)于敏感人群, 較多地?cái)z入苯甲酸及其鹽會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng), 例如哮喘、蕁麻疹、代謝性酸中毒和抽搐等癥狀[8-9]，過(guò)少起不到防腐效果。因而對(duì)小兒清熱止咳顆粒中的防腐劑苯甲酸的用量應(yīng)該嚴(yán)格控制。為保證用藥安全，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該制劑中苯甲酸的HPLC含量測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)研究，并對(duì)30家企業(yè)各2批次的苯甲酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2030高效液相色譜儀(Labsolution工作站)，自帶檢測(cè)器，瑞士Mettler XP205型(精密度為十萬(wàn)分之一)和Mettler XP504(精密度為萬(wàn)分之一)電子天平。

1.2 試藥 苯甲酸，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為(100419-201302)，純度大于99%。乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；水(娃哈哈純凈水)。

2 色譜條件

色譜柱Inertsustain C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) 柱，柱溫35℃；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/mL乙酸銨溶液(5∶95)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 ～ 700 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)苯甲酸在223 nm處有最大吸收，如圖1所示。根據(jù)樣品特征及前處理過(guò)程中試劑的干擾情況，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

圖1 苯甲酸的HPLC紫外吸收?qǐng)D譜

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取苯甲酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于50 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，制成濃度為1.8044 mg/mL的對(duì)照品溶液。對(duì)照?qǐng)D譜如圖2所示。

圖2 苯甲酸的HPLC圖譜

3.3 供試品溶液的制備 對(duì)30家企業(yè)57批次樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。精密吸取0.2 mL于10 mL的容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。供試品圖譜如圖3所示。

圖3 樣品的HPLC圖譜

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取苯甲酸對(duì)照品母液6.8 mL于50 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，制成245.3984 μg/mL的目標(biāo)溶液。再分別精密量取0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 mL分別置于10 mL的容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下分析，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)為峰面積進(jìn)行線性回歸，苯甲酸對(duì)照品在一定范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。

表1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖4 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.5 檢出限 取對(duì)照品溶液，稀釋至對(duì)照品色譜峰高達(dá)到3倍信噪比，得到苯甲酸的檢出限為9.816 ng/mL。

3.6 精密度 精密量取濃度為245.3984 μg/mL的苯甲酸對(duì)照品2.5 mL置于10 mL的容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得苯甲酸峰面積RSD為0.053%，表明儀器精密度很好。

3.7 重復(fù)性 精密量取供試品溶液0.2 mL共6份，分別置于10 mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析，RSD 為1.81%。

3.8 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，按上述方法提取后在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h在上述色譜條件下分析，測(cè)得苯甲酸峰面積RSD為0.412%，表明樣品在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 加樣回收試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.1 mL共6份，分別置于10 mL的容量瓶中，精密加入溶液濃度為245.3984 μg/mL的苯甲酸對(duì)照品1.0 mL，以流動(dòng)相稀釋至刻度。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率

3.10 耐用性 精密量取供試品溶液0.2 mL共兩份分別置于10 mL的容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。采用不同色譜柱對(duì)同一樣品在上述色譜條件下進(jìn)行分析，色譜柱①島津柱子InertSustain C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)、②waters柱子X(jué)SELECT CSH C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)③Agilent柱子 EcLipse XDB-C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) 。不同柱子測(cè)得的結(jié)果RSD為1.48%，表明樣品耐用性良好。見(jiàn)表3。

表3 耐用性

3.11 樣品的測(cè)定 對(duì)于口服液體制劑，《中國(guó)藥典》2015年版一部明確規(guī)定，苯甲酸含量不得超過(guò)0.3%[10]，對(duì)以上30家企業(yè)57批次樣品的苯甲酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，大部分廠家苯甲酸含量均勻，都在合格范圍之內(nèi)，個(gè)別企業(yè)苯甲酸含量很低，幾乎為零，也有個(gè)別廠家的苯甲酸含量已超出合格范圍。見(jiàn)表4。

表4 苯甲酸的含量

4 結(jié)論

苯甲酸本身毒性較大，故針對(duì)兒童藥，世界上有許多國(guó)家已經(jīng)禁止使用。但本次抽樣的30家企業(yè)57批次樣品均以苯甲酸為防腐劑，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，部分企業(yè)苯甲酸用量已經(jīng)超標(biāo)，這對(duì)消費(fèi)者的健康而言具有較大的威脅，尤其小兒清熱止咳口服液是兒童藥，對(duì)于免疫系統(tǒng)和排毒代謝能力較弱的兒童來(lái)說(shuō)，過(guò)量的防腐劑會(huì)對(duì)自身健康造成更大的危害[11]。故生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中不能只考慮產(chǎn)量、銷(xiāo)量，應(yīng)該把消費(fèi)者的健康利益放在首位。