消瘀跌打藥酒制劑和其主藥通城虎藥材中馬兜鈴酸I的成分分析

張 明 梁志云 張俊杰 張健民 余 香 昌水平 蔣三元

廣東省江門市新會區中醫院，廣東 江門 529100

通城虎，又名大力王藤、五虎通城、定心草等，為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎AristolochiafordianaHemsl.的根或全株，其味苦、辛，性溫，有小毒，有解毒消腫、祛風鎮痛、行氣止咳之功[1]，是兩廣及香港地區常用中草藥，在廣東新會地區民間被廣泛使用，常用于胃痛、風濕骨痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等。通城虎是我院傳統制劑消瘀跌打藥酒中的主要藥材之一，該制劑具有驅風活血、散瘀止痛的功效，用于跌打腰痛、扭挫傷。通城虎含馬兜鈴酸類成分可在體內經一系列硝基還原酶代謝活化后與DNA共價結合形成加合物而誘發癌變,并通過誘導腎小管上皮細胞凋亡及間質纖維化而導致“馬兜鈴酸腎病 ”(AAN)[3]。馬兜鈴酸主要含有馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II兩種化合物，其中前者是馬兜鈴酸主要的毒性成分，為了確定通城虎和其消瘀跌打藥酒制劑的毒性成分含量，有效控制其內在質量和臨床用藥的安全，本實驗參考有關文獻報道[4-6]，采用高效液相色譜法，對通城虎藥材和消瘀跌打藥酒制劑中的馬兜鈴酸I進行含量測定，現報告如下。

1 儀器和試藥

1.1 主要儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(日本)；Jeken PS-10超聲波清洗器(潔康超聲波清洗機有限公司)；HZK-FA210電子天平(福州華志科學儀器有限公司)；MILLIPORE超純水器(廣州東銳科技有限公司)。

1.2 試藥 馬兜鈴酸I對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110746-201611)；通城虎藥材共2批次(160201，1905001)；消瘀跌打藥酒(江門市新會區中醫院配制，批號：20190301、20190725、20191126)；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-XP柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.05%冰醋酸溶液(53∶47)，檢測波長250 nm，流速為 1 mL·min-1，柱溫為30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 流動相的選擇 選用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行試驗[7]，結果樣品色譜圖中出現連續峰、分離度差。根據文獻資料[8-9]，選用甲醇-0.05%冰醋酸溶液為流動相進行試驗，所得色譜圖中馬兜鈴酸I的分離度大于1.5，峰形良好，保留時間適合，作為本實驗的流動相。

2.3 供試液的制備

2.3.1 對照品儲備液的制備 精密稱取馬兜鈴酸I對照品約9.71 mg，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶液，振蕩溶解，加甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液儲備液，濃度為194.2 μg·mL-1。

2.3.2 馬兜鈴酸I對照品溶液的制備 精密吸取2.2.1對照品儲備液1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為馬兜鈴酸I對照品溶液，濃度為9.71 μg·mL-1。

2.3.3 通城虎供試品溶液的制備 精密稱取通城虎藥材粉末0.5150g，先加入10%氨水20 mL，浸泡40 min，超聲處理30 min，濾過，濾液用乙醚洗滌2次，每次20 mL，棄去乙醚洗滌液，取水層加入稀鹽酸調pH至3～4，再用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚萃取液，水浴蒸干，殘渣用甲醇10 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

2.3.4 消瘀跌打藥酒供試品溶液的制備 精密量取消瘀跌打藥酒60 mL，水浴蒸干，殘渣先加入10%氨水20 mL溶解，濾過，自濾液用乙醚洗滌2次，每次20 mL起，按2.3.4通城虎供試品溶液的制備方法操作，作為消瘀跌打藥酒供試品溶液。

2.3.5 消瘀跌打酒陰性對照溶液的制備 取缺少通城虎藥材的消瘀跌打酒陰性樣品60 mL，按2.3.4消瘀跌打藥酒供試品溶液的制備項下操作，作為陰性對照品溶液。

2.4 系統適應性試驗 在2.1項下色譜條件下，分別精密吸取馬兜鈴酸I對照品溶液、消瘀跌打藥酒供試品溶液、消瘀跌打藥酒陰性對照溶液和通城虎供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀進行測定。結果表明，消瘀跌打藥酒供試品液與馬兜鈴酸I對照品液的峰型和保留時間一致，消瘀跌打藥酒陰性對照無干擾。如圖1所示。

圖1 HPLC色譜譜

2.5 線性關系 精密量取2.2.1 對照品儲備液5份，每份1 mL，分別加甲醇稀釋至50、25、20、10、5 mL，搖勻，濃度分別為3.884、7.768、9.71、19.42和38.84 μg·mL-1。注入高效液相色譜儀，在2.1項下色譜條件下測定，以吸收峰面積Y為縱坐標，對照品溶液的進樣量X為橫坐標，計算得回歸方程：Y=55825X-12839，相關系數r=0.9999。結果表明，馬兜鈴酸I對照品在0.03～0.38 μg范圍內的進樣量與色譜峰面積值的線性關系良好。

2.6 精密度試驗 取馬兜鈴酸I對照品溶液，每次10 μL，連續重復進樣5次，測定馬兜鈴酸I對照品峰面積的RSD為0.92%。

2.7 穩定性試驗 取同一通城虎和消瘀跌打藥酒供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、24 h進樣，其馬兜鈴酸I峰面積的RSD分別為1.24%、1.09%。試驗表明供試品24h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 分別取消瘀跌打藥酒(批號：20190301)和通城虎(批號：160201)各5份，按上述供試品溶液的制備操作；計算馬兜鈴酸I的含量。消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I的平均含量為0.7133 μg·mL-1，RSD為1.31%；通城虎中馬兜鈴酸I的平均含量為0.0623 mg·g-1，RSD為1.09%。

2.9 回收率試驗 精密吸取已知含量的消瘀跌打藥酒樣品(20190301，馬兜鈴酸I含量為0.7133 μg·mL-1)30 mL，稱取已知含量的通城虎樣品(160201，馬兜鈴酸I含量為0.0623 mg·g-1)約0.25 g，各制備5份，分別精密加入一定量的馬兜鈴酸I對照品，按上述供試品溶液的制備與測定方法操作，計算馬兜鈴酸I的回收率。消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I的回收率平均為99.08%，RSD為0.61%；通城虎中馬兜鈴酸I的回收率平均為98.65%，RSD為1.58%。

2.10 樣品含量測定 按2.2.4項制備消瘀跌打藥酒供試品溶液并測定，3批制劑樣品中馬兜鈴酸I的含量測定結果見表1；按2.2.3項制備通城虎供試品溶液并測定，通城虎中馬兜鈴酸I含量測定結果見表2。

表1 消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I含量測定結果 (n=3)

表2 通城虎中馬兜鈴酸I含量測定結果 (n=2)

3 討論

首先參考文獻方法[10-11]，使用甲醇提取方法制備供試品溶液，結果得到的色譜圖基線高、色譜峰數量多，而且在馬兜鈴酸I出峰位置有干擾；再參考文獻資料方法[12-14]，結合實驗品種情況作出調整，采用先在堿性水溶液中用乙醚洗滌、去除乙醚的可溶成分，將水層溶液加鹽酸酸化，再用乙醚萃取的提取方法制備供試品溶液，減少樣品中的非測定組分，結果在馬兜鈴酸I出峰位置無干擾，分離度好，色譜峰數量明顯減少，因此選擇上述方法制備通城虎及消瘀跌打藥酒供試液。

本試驗方法進行3批次消瘀跌打藥酒馬兜鈴酸I的含量測定，馬兜鈴酸I的含量在0.7133～0.7298 μg/mL之間，平均含量是0.7206 μg/mL。各批次馬兜鈴酸I的含量相對標準偏差值為1.17%。2批次通城虎中馬兜鈴酸I平均含量為0.0617 mg·g-1。結果表明，建立的通城虎及消瘀跌打藥酒中馬兜鈴酸I高效液相色譜含量測定方法準確、簡便、快速、重復性好，適應藥材及制劑的質量控制的要求。