過表達miR-21對脂多糖誘導人牙髓干細胞炎癥、凋亡和自噬的影響

林玉祥，林慧，車立純，田河

1 廈門醫學院附屬口腔醫院牙體牙髓病二科，福建廈門361000；2 廈門市口腔疾病診療重點實驗室；3 青島市中心醫院口腔科

人牙髓干細胞（hDPSCs）具有自我更新能力、高增殖能力及多向分化能力［1］，具有眾多潛在的臨床治療作用，但炎癥微環境會限制其各種自我更新及分化能力，從而影響其應用［2］。微小RNA（miRNA）是一類內生的、長度為20～24 個核苷酸的小RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用。miRNA 表達與hDPSCs 的增殖、多向分化、衰老和其他生命過程均密切相關［3］。研究顯示，miR-21 廣泛參與機體炎癥、凋亡、自噬等多種病理生理過程［4-6］。NARA等［7］研究發現，miR-21 可減輕脂多糖（LPS）誘導的hDPSCs 炎癥反應。但是，miR-21 對hDPSCs 炎癥反應、凋亡和自噬的影響鮮見報道。為此，我們于2020 年6 月—2021 年2 月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：hDPSCs 購自上海賽百慷生物技術股份有限公司。質粒：miR-21 mimics、miR-NC mimics均購自廣州銳博生物技術有限公司。主要試劑：白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，DMEM 培養基、10%胎牛血清、青—鏈霉素、LPS均購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自美國Gibco 公司，Hoechst 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC/PI 雙染色細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，BCA 試劑盒購自北京百奧萊博科技公司；CD34、CD45、CD90、CD105 抗體均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、死骨片1（p62）、自噬微管相關蛋白輕鏈3 抗體（LC3B）、內參GAPDH 一抗及辣根過氧化酶標記的IgG均購自英國Abcam公司。

1.2 hDPSCs 細胞培養及鑒定 將hDPSCs 置于含10% 胎牛血清和青—鏈霉素雙抗的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。每隔3 d 傳代1次，取第3～4 代、生長狀態良好的細胞，胰酶消化，收集細胞，離心半徑8 cm，1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌，重懸細胞。向相應流式管中加入CD34、CD45、CD90、CD105抗體，通過流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況。結果顯示，hDPSCs細胞表面高表達CD90、CD105，低表達CD34、CD45，證實該細胞為hDPSCs。見OSID碼圖1。

1.3 LPS 濃度篩選 取生長良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，以2×103/孔接種于96 孔板中。培養過夜后，分別加入不同濃度LPS（0、0.1、1、5、10 μg/mL），作用48 h。收取細胞上清液，使用ELISA 試劑盒檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結果顯示，與0 μg/mL LPS 作用后比較，hDPSCs 經0.1、1、5、10 μg/mL LPS 作用后細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高，且不同濃度間比較P均＜0.05。見表1。結合文獻報道，10 μg/mL LPS可顯著降低hDPSCs的細胞存活率［8］。因此，選定5 μg/mL LPS進行后續實驗。

表1 hDPSCs經不同濃度LPS作用后細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，± s ）

表1 hDPSCs經不同濃度LPS作用后細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，± s ）

注：與0 μg/mL LPS作用后比較，*P＜0.05。

LPS濃度0 μg/mL 0.1 μg/mL 1 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL IL-1β 135.68 ± 6.74 185.38 ± 11.28*284.95 ± 8.08*845.62 ± 37.89*924.02 ± 77.42*IL-6 54.00 ± 5.22 87.31 ± 8.27*261.05 ± 22.53*376.70 ± 15.20*460.10 ± 20.47*TNF-α 15.90 ± 2.62 61.63 ± 8.19*100.59 ± 2.98*136.96 ± 7.86*171.72 ± 19.26*

1.4 細胞分組處理 取生長良好的第3～4代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，以1×104/孔接種于96 孔板中。待細胞生長至70% 左右，隨機分為對照組、LPS 組、LPS+miR-NC mimics組、LPS+miR-21 mimics 組，LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組分別使用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染miR-NC mimics、miR-21 mimics。各組作用4 h，更換為含10% 胎牛血清的DMEM 培養基，LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組均加入5 μg/mL LPS，置于培養箱中繼續培養48 h。

1.5 細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平檢測 采用ELISA 法。收集各組細胞上清液，使用ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取生長良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，以1.5×104/孔接種于24 孔板中，按照1.4進行分組處理。胰酶消化后收集細胞，PBS洗滌，加入Binding buffer 緩沖液100 μL，重懸細胞。向細胞混懸液中加入Annexin V-FTIC 溶液5 μL，混合均勻，避光孵育10 min。向細胞中加入PI 5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。置于冰浴中，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 細胞凋亡及自噬相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取生長良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，以7×105/孔接種于24孔板中，按照1.4進行分組處理。胰酶消化后收集細胞，加入RIPA 裂解液，37 ℃水浴30 min，離心后取上清，使用BCA 蛋白質定量試劑盒檢測蛋白濃度。將30 μg 蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳分離，并轉移到PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉1 h，TBST 洗滌3 次。加入Cleaved Caspase-3、p62、LC3B、GAPDH（稀釋比例分別為1∶500、1∶200、1∶3 000、1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入二抗孵育1 h，TBST洗滌3次。ECL發光，凝膠成像系統成像分析條帶灰度值。以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Student-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較 見表2。

表2 各組細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，± s ）

表2 各組細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，± s ）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組及LPS+miR-NC mimics組比較，#P＜0.05。

組別對照組LPS組LPS+miR-NC mimics組LPS+miR-21 mimics組IL-1β 138.73 ± 3.86 780.05 ± 14.45*782.61 ± 20.20*404.87 ± 22.18*#IL-6 60.06 ± 8.82 426.36 ± 48.72*425.42 ± 85.83*194.35 ± 24.39*#TNF-α 9.50 ± 1.06 163.29 ± 30.77*193.05 ± 17.39*29.18 ± 6.02*#

2.2 各組細胞凋亡率比較 對照組、LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組細胞凋亡率分別為1.4% ± 0.2%、30.8% ± 1.3%、31.5% ±0.8%、10.4% ± 0.9%；與對照組比較，LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組細胞凋亡率均升高，且LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組升高更明顯（P均＜0.05）。

2.3 各組細胞凋亡和自噬相關蛋白表達比較 見表3。

表3 各組細胞Cleaved Caspase-3、p62、LC3B蛋白相對表達量比較（± s ）

表3 各組細胞Cleaved Caspase-3、p62、LC3B蛋白相對表達量比較（± s ）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組及LPS+miR-NC mimics組比較，#P＜0.05。

組別對照組LPS組LPS+miR-NC mimics組LPS+miR-21 mimics組Cleaved Caspase-3 0.59 ± 0.05 1.33 ± 0.15*1.32 ± 0.14*0.73 ± 0.07*#p62 0.91 ± 0.08 0.12 ± 0.02*0.13 ± 0.01*0.61 ± 0.05*#LC3BⅠ0.98 ± 0.06 0.28 ± 0.04*0.27 ± 0.04*0.66 ± 0.05*#LC3BⅡ0.37 ± 0.03 0.94 ± 0.11*0.95 ± 0.09*0.53 ± 0.06*#

3 討論

hDPSCs具有多向分化的潛力，能夠分化成牙本質細胞、脂肪細胞和神經細胞。近年來，干細胞治療和再生醫學取得了巨大進展。臨床研究結果表明，hDPSCs 對于牙髓和牙周組織再生以及頜面部骨組織缺損修復是安全有效的［1］。LPS 是革蘭陰性細菌細胞壁的組成成分，是牙髓炎的重要致病因子。研究證實，LPS 可以使hDPSCs 產生大量炎癥因子，誘導發生細胞炎癥反應［9］。本研究結果顯示，LPS可刺激hDPSCs 生成IL-1β、IL-6 和TNF-α，并呈劑量依賴性。因既往文獻報道，10 μg/mL LPS 可顯著降低hDPSCs 的細胞存活率［8］。因此，本研究選定5 μg/mL LPS 進行后續實驗。研究顯示，多種miRNA 參與了牙髓組織炎癥反應的調節過程［10］。在牙髓炎的發生過程中，牙髓組織中多種miRNA 表達改變均可影響hDPSCs 的活性和分化潛能［11］。SONG 等［12］研究顯示，miR-21 介導了LPS 刺激人牙髓成纖維細胞的炎癥過程［13］。本研究結果顯示，與對照組比較，LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics組細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高，且LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組升 高更明顯；表明LPS 可誘導hDPSCs 分泌IL-1β、IL-6 和TNF-α，而過表達miR-21可以顯著抑制LPS誘導的炎癥反應。

細胞凋亡在生物體進化、內環境穩定及多個系統發育中均具有重要作用［14］。有研究表明，細胞凋亡參與調控牙胚組織和牙源性細胞的發育［15］。Caspase-3 是細胞凋亡過程中最重要的末端剪切酶，在正常組織中以非活性方式存在，但在凋亡途徑中會被激活［16］。本研究結果顯示，與對照組比較，LPS組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3表達均升高，且LPS組、LPS+miR-NC mimics 組升高更明顯；表明LPS 可誘導hDPSCs 細胞凋亡，而過表達miR-21 可以顯著抑制LPS 誘導的細胞凋亡。既往研究顯示，miR-21可以通過降低Bax/Bcl-2 和Caspase-3 活性來抑制LPS誘導的腎細胞凋亡，與本研究結果一致［17］。

細胞炎癥反應將刺激各種自噬相關蛋白的表達變化，從而參與炎癥發病機制的調控。LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在臨床多用于評估自噬水平。p62作為自噬的選擇性底物，可進入自噬體并在自噬后期被降解，因此其表達水平通常與自噬水平呈負相關關系。研究顯示，LPS 和成骨誘導液可通過上調hDPSCs中LC3B、p62和Beclin1等自噬相關蛋白表達，而促進hDPSCs 的分化和基質礦化［18］。本研究結果顯示，與對照組比較，LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組、LPS+miR-21 mimics 組細胞LC3B Ⅱ表達均升高，p62、LC3BⅠ表達均降低，且LPS 組、LPS+miR-NC mimics 組變化更明顯；提示LPS 通過上調LC3BⅡ、下調p62 和LC3BⅠ蛋白表達來誘導hDPSCs 發生自噬，而過表達miR-21 可以通過抑制細胞自噬而保護hDPSCs免受LPS的損害。

綜上所述，LPS 可誘導hDPSCs 發生炎癥反應，并促進其凋亡和自噬，而過表達miR-21 可以抑制LPS 的上述作用。本研究不僅為研究牙髓炎反應的病理損傷提供了理論依據，也為預防和治療牙髓病提供了實驗依據。