膽堿對腸系膜上動脈缺血再灌注大鼠血管損傷的影響及其分子機制

逯星竹，趙陽，李楠，畢學苑

1 西安交通大學第二附屬醫院藥學部，西安710004；2 西安交通大學第二附屬醫院藥物臨床研究機構辦公室；3 西安交通大學附屬紅會醫院藥劑科

缺血再灌注（IR）損傷是心血管領域的重要研究課題，現已成為治療缺血性心血管疾病亟待解決的關鍵問題。血管損傷是再灌注損傷的重要特征，改善血管功能和結構可能成為防治心血管IR損傷的新方向［1］。膽堿是體內必不可少的營養元素，廣泛參與機體各種生物學進程。近年來研究發現，膽堿具有心血管保護作用，能夠延緩心肌肥大的病理進程，抑制心肌細胞增大及有害的心肌重構［2］。還有研究表明，膽堿具有延緩心臟衰老的作用［3］。此外，膽堿可通過抑制Akt/mTOR通路減輕IR誘導的心肌細胞凋亡和自噬［4］。本課題組前期研究結果顯示，膽堿能夠改善IR 導致的血管功能障礙［5］，但其作用機制還需深入探究。2019年10月—2020年12月，本研究建立大鼠腸系膜上動脈IR 模型，觀察膽堿對血管損傷的影響并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性健康SD 大鼠36 只，體質量（220 ± 20）g，8～10 周齡，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。主要試劑：膽堿購自美國Sigma 公司，PKR 樣內質網激酶（PERK）購自美國Cell Signaling Technology 公 司，磷 酸 化PERK（p-PERK）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，免疫球結合蛋白（Bip）購自英國Abcam 公司，磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）購自美國Cell Signaling Technology 公司，磷酸化AMPK（p-AMPK）購自美國Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 購自北京華肽先鋒生物科技有限公司，二抗抗小鼠、抗兔購自北京中杉金橋生物技術有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA 試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，蛋白Maker 購自美國Ferments 公司，ECL 發光液購自美國Millipore 公司，戊巴比妥鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器：Synexgy HT 型酶標儀購自美股Bio-TEK公司，電泳儀購自美國General Electric公司。

1.2 模型建立與分組處理 選擇健康雄性SD大鼠36 只，實驗前24 h 禁食，自由飲水。將大鼠隨機分為假手術組、IR 組和膽堿治療組，各12 只。IR 組建立大鼠腸系膜上動脈IR 模型。方法如下：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg 進行麻醉后，仰臥位固定于操作板上，消毒后腹正中切口，分離腸系膜上動脈；在腸系膜上動脈根部用無創傷血管夾夾閉，阻斷腸系膜上動脈血流60 min，然后松夾，再灌注90 min。膽堿治療組根據體質量舌下靜脈注射膽堿10 mg/kg，10 min 后參照上法建立腸系膜上動脈IR模型。假手術組僅開腹，分離腸系膜上動脈，不進行夾閉。各組實驗結束后，在顯微鏡下迅速分離腸系膜上動脈作為研究標本；部分腸系膜上動脈常規固定后制成切片，病理觀察血管結構和形態；部分大鼠腸系膜上動脈經短暫液氮凍存后，-78 ℃保存備用。

1.3 血管組織病理觀察 采用HE 染色。將分離的腸系膜上動脈置于10% 中性甲醛中，4 ℃固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋與切片。常規進行HE 染色，中性樹膠封片。每組大鼠選取6 張切片標本，光鏡下觀察血管結構和形態學變化。

1.4 血清LDH 水平檢測 采用比色法。各組分離腸系膜上動脈后，于腹主動脈抽取血液3 mL，靜置30 min 后，常溫條件下3 500 r/min離心15 min，分離血清。參照LDH 試劑盒說明書，使用多功能酶標儀檢測LDH 水平，LDH 水平越高提示血管內皮細胞損傷越嚴重。

1.5 腸系膜上動脈組織PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK 檢 測 采 用Western blotting 法。取各組凍存的腸系膜上動脈組織，將2～3 根腸系膜上動脈血管合并為一組，置于1.5 mL EP 管中。稱重剪碎后用組織勻漿機研磨，加入RIPA 裂解液，蛋白抽提試劑提取蛋白，BCA 法進行蛋白定量。進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結束后轉膜至0.45 μm PVDF膜，5 %脫脂牛奶或5% BSA 室溫封閉1 h。加入PERK、p-PERK、Bip、AMPK、p-AMPK 及內參GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育過夜；加入抗小鼠（1∶5 000）或抗兔（1∶5 000）二抗，室溫孵育1 h。ECL發光法進行成像，Gel-Pro軟件進行條帶分析，計算目的蛋白相對表達量及p-PERK/PERK、p-AMPK/AMPK。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血管內皮損傷病理結果比較 假手術組大鼠腸系膜上動脈血管形態完整，血管內皮細胞未見異常；與假手術組比較，IR 組大鼠血管內皮細胞存在空泡變性、炎性浸潤，血管內皮細胞脫落；與IR 組比較，膽堿治療組大鼠腸系膜上動脈血管形態較完整，內皮細胞恢復正常，其病理改變介于假手術組和IR組之間。見OSID碼圖1。

2.2 各組大鼠血清LDH 水平比較 假手術組、IR組和膽堿治療組大鼠血清LDH 水平分別為（430.96 ± 36.45）、（713.47 ± 87.98）、（449.38 ±50.39）U/L，IR 組大鼠血清LDH 水平明顯高于假手術組和膽堿治療組（P均＜0.05），假手術組和膽堿治療組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腸系膜上動脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較 IR組大鼠腸系膜上動脈p-PERK/PERK、Bip 表達均高于膽堿治療組、假手術組，p-AMPK/AMPK 低于膽堿治療組、假手術組（P均＜0.05），膽堿治療組、假手術組上述指標比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。三組PERK、AMPK 表達比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表1、OSID碼圖2。

表1 各組大鼠腸系膜上動脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較（± s）

表1 各組大鼠腸系膜上動脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與IR組比較，#P＜0.05。

組別假手術組IR組膽堿治療組n 4 4 4 PERK 0.40 ± 0.08 0.44 ± 0.08 0.45 ± 0.06 p-PERK/PERK 0.48 ± 0.14 0.82 ± 0.19*0.44 ± 0.14#Bip 0.18 ± 0.05 0.36 ± 0.05*0.21 ± 0.07#AMPK 0.56 ± 0.11 0.60 ± 0.09 0.53 ± 0.11 p-AMPK/AMPK 0.54 ± 0.06 0.31 ± 0.02*0.54 ± 0.08#

3 討論

IR 誘導的血管損傷不僅降低了再灌注所帶來的益處，反而會進一步加重組織結構及功能受損。膽堿作為人體每日必需營養元素，一直為機體提供抵御外界損傷的防護作用，以往對膽堿的研究主要集中在其對心肌的保護作用，近年來關于其對血管的保護效應逐漸成為研究熱點。研究發現，膽堿能夠抑制平滑肌細胞的表型轉化，進而減輕血管重塑［6］；還能夠下調自發性高血壓大鼠腸系膜上動脈中白細胞介素6 和腫瘤壞死因子α 表達，能恢復自發性高血壓大鼠的壓力反射敏感性和血清乙酰膽堿水平［7］。以上研究提示，膽堿具有血管保護作用，并可能作為一種潛在的心血管疾病輔助治療方法。本課題組前期研究發現，膽堿能夠通過調節細胞鈣流向而減輕血管受損及IR 導致的血管功能異常，并指出膽堿的心血管保護作用是通過激活M3 型乙酰膽堿受體而發揮作用的［5］。LDH 是機體中非常重要的糖酵解酶，細胞損傷時，LDH 水平異常增高，因此檢測血清LDH 水平能夠反映血管內皮細胞的損傷程度。本研究結果顯示，與IR 組比較，膽堿治療組大鼠腸系膜上動脈血管形態較完整，內皮細胞恢復正常，其病理改變介于假手術組和IR 組之間，且假手術組和膽堿治療組血清LDH水平明顯低于IR組；提示膽堿能夠降低IR大鼠血清LDH水平，改善血管內皮細胞損傷，減輕IR誘導的外周血管損傷。

內質網是細胞內蛋白質生成和加工的主要場所，Bip/葡萄糖調節蛋白78（GRP78）屬于內質網熱休克反應蛋白70 家族，是一種ATP 依賴的伴侶蛋白［8］。Bip/GRP78 是調節內質網功能的主要蛋白之一，對維持內質網的穩態必不可少，對促進蛋白質正確折疊也至關重要，是激活未折疊蛋白反應的感受器［9］。正常情況下，Bip 與雙鏈RNA 活化的蛋白激酶PKR 樣內質網激酶［（PKR）-PERK］結合，不能與異常折疊蛋白結合；內質網應激發生時存在ATP 水解，使Bip 與異常折疊蛋白之間形成穩定復合物，從而釋放PERK，并引發下游的級聯反應［10-11］。研究顯示，PERK 可通過細胞質內結構域二聚化和自身磷酸化而被激活［12］。研究指出，糖尿病大鼠發生心肌IR后，未折疊蛋白反應激活，GRP78和PERK 磷酸化水平升高，氧化苦參堿預處理能夠減輕內質網應激相關的細胞凋亡［13］。本研究結果顯示，膽堿預處理能夠降低IR 導致的PERK/Bip 通路活化，減輕內質網應激反應，并發揮血管保護作用。

AMPK 在級聯激活的情況下，會增強應激狀態下對細胞的保護作用［14］。IR 的主要靶細胞是心血管內皮細胞和平滑肌細胞，均可直接或間接受到AMPK 調控［15-16］。因此，激活AMPK 信號通路是心血管疾病治療的潛在靶點。研究表明，AMPK 可能是抑制內質網應激相關凋亡通路的重要環節，部分藥物能夠通過激活AMPK通路抑制內質網未折疊蛋白反應的發生，減輕細胞凋亡，從而發揮保護作用，同時該研究提示AMPK 可能是PERK/Bip 的上游信號分 子［17-19］。 已有 研究 證實，膽 堿可 通過SIRT3/AMPK 通路調節酮體和脂肪酸代謝，從而減輕心功能障礙、減少心肌肥厚的發生［20］。本研究結果顯示，膽堿能夠使腸系膜上動脈IR大鼠血管組織p-AMPK蛋白表達升高，增加AMPK活性，提示膽堿可能是通過活化AMPK而減輕IR損傷的。

綜上所述，膽堿能減輕大鼠腸系膜上動脈IR 導致的血管損傷，改善內皮細胞形態和結構，降低LDH 水平，從而發揮血管保護作用，其機制可能與抑制PERK/Bip信號通路、活化AMPK有關。