EZH2基因表達對ox-LDL誘導內皮細胞炎癥反應的影響

李揚，林飛，2，3，陳志剛，2，3，常崢崢，趙奕霖，李東旭，2，李雪芳，2，孫四玉，趙國安，2，3

1 新鄉醫學院第一附屬醫院生命科學研究中心，河南新鄉453100；2 河南省心血管損傷與修復國際聯合實驗室；3 河南省心臟生物醫學工程研究中心

冠心病及其并發癥是心血管疾病患者最主要的死因，動脈粥樣硬化（AS）是冠心病的病理基礎，內皮細胞炎癥是AS 的發病基礎［1-4］。因此，研究內皮細胞炎癥形成的相關機制具有重要意義［5］。AS 是一種表觀遺傳學疾病，其發病機制涉及組蛋白修飾、DNA 甲基化、長鏈非編碼RNA 等［6］。在組蛋白修飾過程中，Zeste 同源復合物2（EZH2）可通過三甲基化組蛋白3的27位（H3K27）改變基因表達，敲除EZH2可抑制前列腺癌、淋巴細胞瘤等腫瘤生長。研究顯示，在高脂飲食的ApoE－/－小鼠中使用EZH2 抑制劑后，小鼠主動脈粥樣斑塊明顯減少［7］；這提示EZH2參與了AS 的發生發展，但EZH2 是否通過影響內皮細胞炎癥而參與AS 目前尚不明確。2019 年1 月—2021 年1 月，本研究采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）構建內皮細胞炎癥模型，通過在細胞中過表達和低表達EZH2 基因，觀察EZH2 表達對內皮細胞炎癥反應的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）及內皮細胞培養基（ECM）均購自美國Science Cell 公司，ox-LDL 購自廣州奕源生物科技有限公司，BCA試劑、ELISA 試劑盒、EZH2 蛋白一抗均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，EZH2、白細胞介素6（IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、一氧化氮合酶（e-NOS）、C 反應蛋白（CRP）及內參GAPDH 引物均購自蘇州金唯智生物科技有限公司，cDNA 反轉錄試劑盒購自上海近岸科技有限公司，PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，EZH2 腺病毒及對照腺病毒購自加拿大Abm 公司，EZH2 特異性抑制劑GSK126購自美國Selleck公司。

1.2 ox-LDL 誘導濃度篩選 將HUVEC 置于含有10% 胎牛血清和1% 青—鏈霉素雙抗的DEME 培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養、傳代。取傳至3～7 代、生長融合至50% 左右的HUVEC，接種至大皿中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。第二天吸棄 廢 液，PBS 沖 洗 兩 遍，分 別 加 入0、25、50、100 μg/mL ox-LDL，培養12、24 h時分別收集細胞上清。采用ELISA 法檢測上清IL-6 水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。結果顯示，相同作用時間下，HUVEC 經25、50、100 μg/mL ox-LDL 作用后上清IL-6水平均明顯高于0 μg/mL ox-LDL 作用后，以100 μg/mL ox-LDL作用后上清IL-6水平升高最顯著（P均＜0.05）；因0 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后上清IL-6 水平升高，說明無ox-LDL 作用的細胞培養24 h時可能已存在炎癥反應，為了排除細胞本身已存在炎癥反應對實驗的影響，選擇100 μg/mL ox-LDL 作用12 h作為后續實驗條件。見表1。

表1 HUVEC經不同濃度ox-LDL作用12、24 h時上清IL-6水平比較（pg/mL，-x ± s）

1.3 EZH2 過表達對ox-LDL 誘導內皮細胞炎癥反應的促進作用觀察

1.3.1 細胞分組及EZH2 過表達處理 將生長融合至70% 左右的HUVEC 接種至大皿中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜。第二天吸棄廢液，PBS沖洗兩遍，分為實驗A 組、陽性對照A 組、陰性對照A 組和空白A 組。實驗A 組、陽性對照A 組分別轉染EZH2 腺病毒及對照腺病毒（病毒感染系數設為75），與DEME 培養基共培養3 h 后換液，PBS 沖洗兩遍，加入DEME 培養基培養48 h，提取RNA 及蛋白檢驗顯示腺病毒轉染成功后，加入100 μg/mL ox-LDL 作用12 h。陰性對照A 組加入100 μg/mL ox-LDL作用12 h，空白A組常規培養12 h。

1.3.2 細胞EZH2 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取各組細胞，用預冷PBS 沖洗兩遍，加入100 μL預先配好的裂解液，收集到1.5 mL離心管中。冰浴30 min，每5 min用移液槍吹打均勻。待細胞充分裂解后，4 ℃條件下12 000 r/min 離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定總蛋白質濃度。加 入1/4 體積 的5×Lodding buffer，100 ℃金屬 浴10 min，自然冷卻后放入-20 ℃冰箱備用。等量上樣，10% SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠（20 μg/孔）、5% SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠（30 μg/孔）進行電泳，轉移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入EZH2 及β-actin 一抗（1∶3 000），室溫孵育過夜；使用TBST 清洗PVDF 膜后，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。化學發光凝膠成像系統成像顯影，Image J進行灰度值分析，計算EZH2蛋白相對表達量。

1.3.3 細胞EZH2 及炎癥指標IL-6、TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA 表達檢測 采用Real-time PCR 法。取各組細胞，預冷PBS 沖洗兩遍后，TRIzol 法提取細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測260/280 nm 波長處吸光度，測量RNA 濃度及純度后合格后，采用兩步法進行反轉錄。PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，40 ℃退火5 s，60 ℃延伸31 s，共40 個循環。采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 細胞上清IL-6水平檢測 采用ELISA法。取各組細胞，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清，-20 ℃冰箱保存備用。在康寧板中使用1×Capture Antibody 包被，4 ℃冰箱過夜。棄液后，加入ELISA/ELISPOT（1×）封閉1 h，加入稀釋好的標準品，其余孔加入各組細胞上清100 μL；孵育2 h后加入1×Detection Antibody，封閉1 h后加入1×Streptavidin-HRP，封閉30 min后加入1×TMB Solution，反應15 min。使用酶聯免疫檢測儀測450 nm波長吸收值，根據標準品濃度及標準品波長制作標準曲線及曲線公式，將各樣品波長吸收值代入公式計算得到IL-6水平。

1.4 EZH2 低表達對ox-LDL 誘導內皮細胞炎癥反應的抑制作用觀察

1.4.1 細胞分組及EZH2 低表達處理 將HUVEC分為實驗B 組、陽性對照B 組、陰性對照B 組和空白B 組。在5 mg GSK126 中加入0.949 4 mL 二甲基亞砜（DMSO），配成10 mmol/L 的儲備液，-20 ℃冰箱備用。取50 μL 儲備液，加入50 mL 培養基，配成后制備成GSK126工作液（濃度10 μmol/L）。實驗B組直接加入GSK126 工作液7 mL，陽性對照B 組加入7 mL 培養基及DMSO 7 μL（實驗組中工作液含0.1% DMSO，故陽性對照B 組中培養基加入含0.1% DMSO 作陽性對照），培養48 h 后，提取RNA及蛋白檢驗是否低表達成功，再加入ox-LDL 100 μg/mL 作用12 h。陰性對照B 組加入ox-LDL 100 μg/mL作用12 h，空白B組常規培養12 h。

1.4.2 細胞EZH2蛋白及各炎癥指標表達檢測 參照1.3.2采用Western blotting法檢測細胞EZH2蛋白表達，參照1.3.3 采用Real-time PCR 法檢測細胞EZH2、TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 mRNA表達，參照1.3.4采用ELISA法檢測細胞上清IL-6水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EZH2過表達后ox-LDL誘導內皮細胞EZH2及各炎癥指標表達比較

2.1.1 各組細胞EZH2 mRNA、蛋白表達及上清IL-6 水平比較 見表2。

表2 各組細胞EZH2 mRNA、蛋白表達及上清IL-6水平比較（-x ± s）

2.1.2 各組細胞TNF- α、e-NOS、IL-8、CRP、IL- 6 mRNA表達比較 見表3。

表3 各組細胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表達比較（± s ）

表3 各組細胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表達比較（± s ）

注：與空白A組比較，*P＜0.05；與陰性對照A組、陽性對照A組比較，#P＜0.05。

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2.2 EZH2低表達后ox-LDL誘導內皮細胞EZH2及各炎癥指標表達比較

2.2.1 各 組 細 胞TNF- α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 mRNA表達比較 見表4。

表4 各組細胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表達比較（± s ）

表4 各組細胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表達比較（± s ）

注：與空白B組比較，*P＜0.05；與陰性對照B組、陽性對照B組比較，#P＜0.05。

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2.2.2 各組細胞EZH2 mRNA、蛋白表達及上清IL-6水平比較 見表5。

表5 各組細胞EZH2 mRNA、蛋白表達及上清IL-6水平比較（-x ± s）

3 討論

內皮細胞在AS 形成中具有重要作用，內皮細胞炎癥損傷后，細胞通透性增加，細胞間連接變得寬松，使得巨噬細胞通過內皮細胞間隙，吞噬脂質后進入斑塊內部，從而促進粥樣硬化斑塊形成［8-9］。TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 等細胞炎癥因子在炎癥反應中具有核心作用，上述因子不僅招募趨化因子，促使巨噬細胞通過內皮細胞間隙進入血管內壁，且其可以招募生長因子，進一步加速斑塊形成，最終促進AS形成［10］。因此，內皮細胞炎癥途徑引起AS 發病的相關機制研究及相關通路靶點阻斷可以為AS 的預防及治療提供可參數據。本研究通過ox-LDL刺激HUVEC 而構造內皮細胞炎癥模型，結果顯示100 μg/mL ox-LDL作用12 h為最佳作用條件。

現代研究顯示，表觀遺傳調控參與AS 的形成、發生和發展［11］，其中EZH2 作為聚梳阻抑復合物2（PRC2）的核心成分，可通過調控表觀遺傳參與內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖、遷移以及巨噬細胞極化，最終參與AS形成與發展。研究顯示，EZH2通過介導lncRNA OIP5-AS1，促進ox-LDL 誘導的血管內皮細胞凋亡［12-13］。EZH2 還可通過調節ATG5、ATG7和MEK-ERK112信號通路傳導，從而抑制細胞自噬、促進血管平滑肌細胞凋亡；同時，EZH2 能夠抑制ABCA1 表達，從而升高巨噬細胞中的脂質水平［14-15］。但目前鮮見關于EZH2 對內皮細胞炎癥影響的研究。本研究通過構建EZH2 的腺病毒載體轉染HUVEC 及使用EZH2 特異性抑制劑GSK126 抑制HUVEC 中EZH2 轉錄激活，而建立EZH2 高表達和低表達的HUVEC炎癥模型；結果顯示，EZH2過表達可以促進ox-LDL 刺激HUVEC 分泌IL-6、TNF-α、IL-8、e-NOS 等炎癥因子，抑制EZH2 表達則抑制ox-LDL 刺激HUVEC 分泌炎癥因子，證實EZH2 具有促內皮細胞炎癥的作用。但是本研究未對具體機制進行探討，關于EZH2 通過何種機制促進內皮細胞炎癥因子的產生尚不明確，EZH2是否在動物實驗中有相同作用仍需進一步驗證。本研究中，EZH2表達對于HUVEC 中IL-6、TNF-α、IL-8、e-NOS 表達均有影響，但是對CRP沒有明顯影響，考慮是由于CRP主要在肝細胞中產生，而不是由血管內皮細胞直接產生導致的。

綜上所述，EZH2過表達可通過靶向調節炎癥因子TNF-α、e-NOS、IL-8、IL-6 表達而引起內皮細胞炎癥，從而參與AS形成，而抑制EZH2表達則具有相反作用。這提示EZH2在AS發生和發展中具有重要作用，EZH2 抑制劑的應用可能成為預防和治療AS 的一種有效方法。