基于流感病毒血凝素的通用疫苗研究進展

孟 薇，張 蕾，黃金海

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

流行性感冒是由流感病毒感染引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，嚴重危害人類和動物健康［1］。疫苗接種是預防和控制流感病毒感染的最有效且經濟的措施［2］。世界衛生組織流感中心每年都會針對流感病毒的流行狀況預測下一年的流行毒株，將其作為疫苗候選毒株。抗原漂移是流感疫苗需要每年更新的主要原因［3］，對疫苗的開發和疾病的防控形成重大挑戰。目前，使用的季節性流感疫苗只對與疫苗毒株相同或高度相似的流感病毒毒株具有預防和保護效力［4］，當流行毒株與疫苗毒株不匹配時，季節性流感疫苗無法預防不同亞型流感病毒引起的流感，導致發病率和死亡率顯著增加，嚴重時甚至發生流感大流行。因此，迫切需要研發一種廣譜的可抵御不同亞型的流感病毒通用疫苗，該疫苗可對不同流感病毒毒株和亞型提供廣泛的保護，解決流感病毒的快速傳播。本研究簡要介紹目前存在的通用疫苗的分類并基于血凝素HA的通用疫苗研究進展，以期為這方面研究提供參考。

1 血凝素的結構與功能

血凝素（Hemagglutinin，HA）蛋白是甲型流感病毒的主要囊膜表面的主要糖蛋白，也是目前研究最深入的流感病毒相關蛋白，可與紅細胞受體結合導致紅細胞凝集，具有免疫原性，與宿主細胞表面的受體的特異性結合有關，在流感病毒入侵感染過程中發揮著關鍵作用。HA蛋白是1個以三聚體形式存在于類脂膜上的蛋白，在結構上含有信號肽、跨膜區、胞漿區和胞外域4個結構域［5，6］。3個HA單體（HA0）以非共價鍵的形式結合成為同源三聚體，存在于病毒包膜上面。HA單體可被蛋白酶裂解成為HA1和HA2兩條鏈，HA1和HA2以二硫鍵相連。每個HA單體由球狀頭部區域和桿狀莖部區域兩部分組成。球狀頭部由HA1組成，含有抗原決定簇和受體結合位點（Receptor binding site，RBS），并在分子表面暴露，呈口袋狀，是流感病毒感染復制的一種必需蛋白，是中和抗體的結合靶點［7］。因此，HA頭部是用于疫苗研制的重要靶抗原。HA蛋白莖部由HA2和部分HA1殘基組成，HA2亞基N端有一段高度疏水的區域，相對保守，與病毒囊膜相連，由α螺旋通過疏水作用穩定三聚體的結構［8］。

HA蛋白在與宿主細胞表面受體結合、膜融合、病毒顆粒包裝結合和病毒粒子致病性等多方面都發揮著重要作用［9］。在病毒感染過程中，HA蛋白前體HA0成熟組裝成三聚體，運輸到宿主細胞表面，在宿主蛋白酶的作用下，裂解生成HA1和HA2 2個亞單位［10，11］。HA1蛋白通過與宿主細胞表面的糖蛋白結合，使病毒顆粒附著在宿主細胞表面，再通過內吞途徑進入細胞［12］；HA2蛋白N端的疏水性區域肽鏈暴露，在內吞泡呈酸性環境的條件下發生構象重排，從而病毒包膜與內吞泡膜融合，并釋放病毒核糖核蛋白復合物到細胞質中［13-15］。在受體親和力方面，不同亞型的HA蛋白對不同宿主細胞表面受體具有的親和力不同，影響不同的宿主。該蛋白可以特異性地識別N-乙酰基唾液酸化的唾液酸寡糖，并以α-2，6糖苷鍵形式或α-2，3糖苷鍵形式結合宿主細胞表面的唾液酸受體，從而啟動流感病毒感染過程［16］。研究發現，禽流感病毒主要通過α-2，3糖苷鍵形式與唾液酸受體結合，而人呼吸道上皮細胞表面的唾液酸主要以α-2，6糖苷鍵相連［17］。豬的呼吸道上皮細胞既分布了α-2，6唾液酸受體，又分布著部分α-2，3唾液酸受體，這說明豬能同時感染禽流感和人流感，病毒較易發生跨種傳播［18］。在致病性方面，HA分子的切割位點處連續存在的堿性氨基酸是判斷流感病毒致病性的一個重要分子標志，HA1蛋白部分氨基酸突變會對流感病毒的致病性產生較大影響［19，20］。

血凝素蛋白作為流感病毒的一個主要保護性抗原，能夠通過刺激機體誘導產生相應的中和性抗體來達到中和病毒感染的目的［21］。HA頭部含有大量的抗原表位區域，莖部的保守區域含有幾種廣泛中和抗體的靶點，兩者具有廣譜中和多種甲型流感病毒亞型的能力。因此，甲型流感病毒HA蛋白頭部區域抗原表位和莖部區域抗原表位是研究抗體中和病毒感染機制、疫苗開發的非常重要且有吸引力的靶點。

2 通用流感疫苗分類

目前，預防甲型流感病毒的主要手段就是接種疫苗，其中接種滅活疫苗和亞單位疫苗仍是抵抗季節性流感病毒最有效的2種方式。由于流感病毒抗原變異速度較快，上一年的疫苗通常不能對這一年的流感病毒起到保護作用，接種者不能在新一年獲得對當年新型流感病毒的抵抗力，因此，科學家們在努力開發一種通用流感疫苗，即一種能夠預防大部分甚至所有亞型流感病毒毒株，保護機體免受病毒感染的疫苗。目前，通用流感疫苗的研究工作旨在誘導對流感病毒表面蛋白或內部蛋白高度保守區域的廣泛保護性免疫，主要靶向為流感病毒表面糖蛋白HA和NA、基質蛋白M2及T細胞免疫等［22］。

2.1 基于NA蛋白的通用流感疫苗

NA蛋白是甲型流感病毒的另一個主要表面糖蛋白，與病毒粒子的釋放密切相關。抗NA的抗體雖然不具有病毒中和作用，但可以抑制NA的活性，降低病毒滴度，是研究新型流感疫苗的一個重要靶點［23］。為了評估流感病毒NA作為疫苗抗原的交叉保護潛力，Kim等［24］制備N1-VLP疫苗免疫小鼠后檢測到NA抑制活性，再用H1N1、H5N1和H3N2 3種毒株攻擊小鼠，表明N1-NLP疫苗具有保護小鼠免受流感病毒感染的潛力。在乙型流感病毒NA免疫試驗中也發現了該現象，且當受到維多利亞系乙型流感病毒的致死性攻擊時，該疫苗可保護小鼠免于發病和死亡［25］。

2.2 基于M2蛋白的通用流感疫苗

流感病毒基質蛋白M2通過其離子通道活性調節pH，在內吞過程中促進基質蛋白M1從核糖核蛋白復合物中解離［26，27］。早期通用流感疫苗的研究主要針對高度保守的流感病毒基質蛋白M2的胞外域M2e［28-31］。目前，研究已經證明小鼠血清中的特異性M2e抗體可以保護BALB/c小鼠抵抗同種類型的流感病毒的攻擊［32-34］。與未免疫組相比，免疫了M2e的小鼠在流感病毒攻擊后存活率提高約60%［35］，并激活了特異性T細胞免疫［36，37］。同時，在異源亞型流感病毒的攻擊后，M2e-VLP疫苗通過降低機體肺部病毒滴度和降低小鼠體重減輕程度來達到顯著交叉保護作用［38，39］。因此，基于M2e蛋白的疫苗研究也是一種新型流感通用疫苗研究策略。

2.3 基于T細胞免疫的通用流感疫苗

機體對流感病毒的免疫反應是由先天性免疫和適應性免疫共同控制的。先天性免疫限制最初的病毒復制，是非特異性的；只有強大的適應性免疫才能有效清除流感病毒，激活體液免疫和細胞免疫。常規的流感疫苗旨在誘導對流感病毒的體液免疫，由于病毒抗原變異的發生，這些疫苗并不完全具有保護作用。科學家們近幾年發現T細胞反應可能在預防流感病毒感染中具有關鍵作用［40-45］，CD8+細胞和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）可介導病毒清除并且已顯示出對不同亞型流感病毒具有交叉反應性免疫作用［46-49］。目前，研究人員正在探索主要刺激流感特異性T細胞免疫的疫苗［50，51］，作為提高流感疫苗效力和開發通用流感疫苗的一種途徑，大部分疫苗選擇靶向保守的流感病毒內部蛋白或其他高度保守的可刺激T細胞介導的免疫反應的抗原決定簇。Valkenburg等［52］研究發現，表達了H5N1亞型流感病毒的HA、NA、M1、M2和NP蛋白的T細胞表位肽的重組疫苗免疫小鼠后，該疫苗可保護小鼠抵抗來自同源或異源流感病毒的攻擊。將流感特異性CD4+T細胞耗竭后再進行疫苗接種，病毒攻擊后小鼠的存活率降低，說明該疫苗介導的保護作用依賴于流感特異性CD4+T細胞。這些發現對開發和優化T細胞活化疫苗具有重要意義。

3 靶向流感病毒HA的通用疫苗的研究進展

除了上述介紹的幾種靶點通用疫苗，目前深入的廣譜疫苗主要是基于甲型流感病毒血凝素HA的通用疫苗，可分為無頭HA疫苗、嵌合疫苗、計算優化抗原（COBRA）疫苗、病毒樣顆粒（VLP）疫苗和馬賽克疫苗等［53，54］，如圖1所示。

圖1 基于血凝素HA的通用流感疫苗研究分類

3.1 基于無頭HA的通用疫苗的研究進展

由于HA頭部易發生突變造成抗原漂移，而莖部的結構和序列在不同亞型間高度保守，可以產生廣泛的免疫反應［55］，能夠克服抗原漂移，因此研究人員嘗試去掉流感病毒HA蛋白的頭部，將HA蛋白的莖部作為通用疫苗的候選區域。Sagawa等［56］用分別過表達無頭（Headless）HA和全長HA的細胞免疫小鼠，用甲型H1N1流感病毒攻擊后，Headless HA組免疫的小鼠的存活率大于對照組，即說明HA莖部有一定的免疫抗性。John等［57］將流感病毒HA莖部的保守性區域制備疫苗免疫小鼠并設計攻毒試驗，發現盡管HA莖部構象不完整，不能產生中和抗體，但靶向HA莖部的抗體能夠阻止HA蛋白水解，抑制病毒與細胞膜融合，延長小鼠生存時間，從而加快機體清除病毒能力，保護小鼠免受甲型H1N1、H5N1和H6N1病毒的致死性攻擊，且當小鼠存在預存免疫力時，觀察到的保護作用增強。張立霞等［58］利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統，將Headless HA轉染昆蟲細胞，發現HA能夠表達但不能使紅細胞發生凝集。Park等［59］評估了受試志愿者在病毒攻擊前后體內的抗HA莖部抗體的滴度及其對機體的保護作用，表明抗HA莖部抗體在人類流感疫苗研發過程中可作為新型疫苗起作用。

3.2 基于HA的嵌合疫苗的研究進展

3.2.1 嵌合HA疫苗 制備嵌合HA疫苗是另一種提高HA莖部區域抗原性的方法，即表達了一種亞型流感病毒的HA頭部區域和另一種亞型流感病毒HA的頭部或莖部區域制備的疫苗［60-62］，能夠誘導產生針對季節性流感的廣泛性抗體［63，64］。早期的HA嵌合疫苗是將編碼2種亞型流感病毒的HA1克隆至同一載體上制備的DNA嵌合疫苗。王芙艷［65］將編碼A、B兩種亞型流感病毒HA1基因構建到表達載體pCAGGSP7上并免疫小鼠，發現該嵌合HA疫苗可同時產生針對2種亞型的特異性抗體，并可保護小鼠抵抗流感病毒的致死性攻擊，提供交叉保護作用。Krammer等［45］將表達了H9亞型HA蛋白頭部序列和H1亞型HA蛋白莖部序列的嵌合疫苗免疫小鼠，發現小鼠體內能夠產生針對HA莖部的廣譜中和抗體，且對同組類型流感病毒毒株的攻擊起到保護作用。Nachbagauer等［66］還將表達了H8亞型HA頭部序列、H1亞型HA莖部序列和N1亞型的NA序列的質粒制備的嵌合疫苗免疫雪貂，同時免疫2種季節性流感疫苗作為對照，也發現了相比于季節性流感疫苗，嵌合疫苗提供的交叉保護作用更強。嵌合疫苗是新型流感疫苗研發的流行趨勢之一，優勢之處在于嵌合疫苗可應對最新一年的流感毒株，在疫苗制備過程中只需將最新一年的流感病毒HA頭部替換以往的有效嵌合疫苗中的HA部分，即可制備交叉保護性較高的廣譜性疫苗；除了HA頭莖部嵌合疫苗外，還可以將流感病毒HA與其他致病性毒株的主要保護性抗原結合起來，起到預防2種病原體感染的作用。

3.2.2 馬賽克HA疫苗 馬賽克疫苗是在嵌合疫苗基礎上擴展的疫苗，是廣譜疫苗研究的熱點之一［67］。該疫苗設計依托于HIV馬賽克疫苗設計原理［68］，即將流感多種抗原（基因片段）組合在一起，形成對機體免疫系統有較強刺激作用并能生成有效抗體的疫苗。2014年Kamlangdee等［69］首次將2 145株H5N1流感病毒毒株分離并分析抗原表位后制得馬賽克疫苗，該疫苗不僅可保護小鼠抵抗H5亞型流感病毒致死性攻擊，還可抵抗季節性流感H1N1的攻擊，起到了廣泛的交叉保護作用。Broecker等［70］研究發現，馬賽克疫苗免疫小鼠和雪貂后，機體可以產生頭部特異性抗體，且產生的抗體水平要大于季節性流感疫苗免疫后產生的抗體水平，能夠誘導出更高的HI滴度。Kanekiyo等［71］將來自多種菌株蛋白的受體結合區域RBD展示在納米粒子表面制備馬賽克疫苗，與不同亞型單個菌株RBD展示納米粒子制備的嵌合疫苗混合物相比，馬賽克疫苗產生的中和性抗體更多，且抗體反應更廣泛。基于HA的馬賽克疫苗研究為流感通用疫苗的研究提供了新的思路和方法，雖然目前研究成果與真正意義上的、有效的臨床應用疫苗相距甚遠，但具有重要的參考意義和應用價值。

3.3 基于HA的VLP疫苗的研究進展

重組流感病毒樣顆粒（VLP）指由多個病毒結構蛋白組成但不包含病毒基因組，可通過外源表達并純化的非傳染性病毒顆粒，具有免疫原性和生物學活性，目前已被證明可刺激機體產生強烈免疫反應并誘導產生針對不同種流感病毒的保護性抗體［72］。Galarza等［73］分析了1918年大流行流感病毒毒株VLPs的組成和三維結構，發現HA分子莖部區域均勻地分布在VLP表面，HA構象處于預融合狀態，可以產生靶向HA莖部的特異性抗體。血凝試驗顯示共表達HA、NA、M1、M2這4種蛋白的病毒樣顆粒具有凝集雞紅細胞的活性，且制備的VLPs免疫小鼠產生的抗體能保護小鼠免受致死性流感病毒的攻擊［74］，即說明VLP疫苗具有抗原保護作用，是一種新興疫苗研發策略。除此之外，H1亞型、H3亞型、H5亞型和H7亞型流感病毒HA蛋白制備的VLPs免疫小鼠后，也可保護小鼠機體免受來自同源或H2、H6、H10和H11等異種亞型流感病毒毒株的致死性攻擊［75］，說明該VLP疫苗還具有交叉保護作用。在2009年墨西哥流感爆發前提下的健康人類試驗中，還發現了VLP疫苗可在較短時間內刺激機體產生特異性抗體，兩劑便具有高血清保護率［76］，由于其高的安全性和免疫原性，基于HA的VLP疫苗的研究為通用流感疫苗的開發提供了一種新的可能。

3.4 基于HA的COBRA疫苗的研究進展

COBRA疫苗即通過計算方式優化的HA多肽疫苗，通過一系列的HA蛋白比對和隨后共有序列的產生來研發優化的HA多肽，可以引起針對流感病毒的廣泛反應性免疫應答［77，78］。研究人員分析了2004—2006年Clade 2分支H5N1流感病毒所有HA蛋白序列并篩選出最保守的氨基酸位點并合成COBRA HA序列，制備的COBRA-VLP疫苗免疫小鼠和雪貂后發現血清中具有較高的HI抗體滴度［79］，且與單個亞型的HA VLP混合物疫苗相比，COBRA疫苗可保護小鼠和雪貂免受同組不同亞型流感病毒的致死性攻擊［80］。在非人靈長類動物模型食蟹猴中也觀察到該現象，同時還可保護機體，降低炎癥反應的發生［81］。此外，研究發現在COBRA疫苗中添加油乳劑可提高疫苗產生抗體反應的強度和廣度，更大范圍地產生特異性抗體［80］。同時，由于COBRA疫苗在研發制備過程中分析了蛋白序列，研究人員可以得到相同亞型不同源或不同年份的流感病毒HA的主要的糖基化位點變化，可通過改變糖基化位點提高其誘導機體產生的中和能力［82］，還可以擴大交叉保護作用［83］。

4 流感病毒通用疫苗開發存在的挑戰

目前，甲型流感病毒大流行前預保護疫苗的研發仍存在如目標流感毒株是否正確、預測及免疫接種程序仍需優化等諸多挑戰。同時，研究發現，先前存在的免疫對流感病毒感染和疫苗接種的抗體反應有很大影響，預先存在的免疫也會降低LAIV的復制［84］，對評估新型疫苗在人群中是否提供廣泛的且持久性保護作用有干擾。同時，改變免疫途徑和優化免疫程序也對制備出具有誘導廣泛保護性免疫的通用流感疫苗有重大意義［85，86］。

5 小結及展望

動物模型與人體臨床模型都證明基于血凝素HA的流感通用疫苗具有良好的免疫原性和交叉保護性，是通用流感病毒候選疫苗側重的表位之一。對基于HA的通用流感疫苗的生產及改進和廣泛性中和抗體的開發及制備有助于預防流感病毒感染并有機會在將來省去流感疫苗的季節性修訂。但是開發具有廣泛保護作用的流感通用疫苗尚未實現，仍需要人們密切監測流感毒株，分析生物學特性，改進疫苗接種方法，最終制備高效、安全的通用流感疫苗。