原花青素的研究進展

劉玟君，李金洲，陳子雋，黃周艷，陳 勇

（1.廣西中醫藥科學實驗中心，南寧 530200；2.深圳市中西醫結合醫院，廣東 深圳 518027；3.桂林市人民醫院，廣西 桂林 541002）

原花青素（Procyanidins，PC）是一類由不同數量的兒茶素或表兒茶素通過C-C鍵縮合而形成的聚合物，又稱為縮合單寧［1］。根據原花青素聚合度的不同，又可分為單體、低聚和高聚原花青素，其中以二聚體分布最廣［2，3］。原花青素廣泛存在于多種植物的果、葉、子、皮中，其中葡萄子中原花青素的含量高達95%［4］。原花青素具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮細胞、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖等藥理活性［5］。研究發現，原花青素的活性與其化學結構有關，聚合度較低的原花青素抗氧化性活性較強［6，7］。本研究主要對近五年有關原花青素的提取方法、含量測定方法、分離純化以及藥理活性等方面進行整理歸納，以期為原花青素的研究提供指導。

1 原花青素的提取方法

提取是分離、鑒定和利用原花青素的重要步驟。查閱文獻發現，目前對于原花青素的提取方法主要有：溶劑提取法、酶提取法、超臨界CO2提取法、超聲波、微波輔助提取法等。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是根據相似相溶的原理，選取對目標成分溶解度大，而對非目標成分的溶解度小的溶劑，從而將目標成分從原料中提取出來的一種方法。原花青素可溶于水和絕大多數有機溶劑，常用的提取溶劑有水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮等［8］。有研究發現，采用混合溶劑與采用單一溶劑（甲醇、乙醇）對葡萄子中原花青素進行提取，發現混合溶劑的提取率分別提高了13.38%和9.20%［9］。溶劑提取法雖然操作容易，對設備要求較低，但提取時間較長，提取率較低，且所用的有機溶劑很有可能會殘留在目標成分中。

1.2 酶提取法

酶提取法是一種優良的提取方法，有學者利用雙酶法破壞植物細胞壁，促進細胞內的原花青素的快速溶出，再利用溶劑回流使原花青素成分有效提取出來，酶法提取能在一定程度上提高提取率，在生物活性物質提取方面已被廣泛利用［10，11］。常用的酶有纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，其中pH、酶解時間、溫度等因素都會影響酶活性，所以必須嚴格控制反應參數，且酶可能會造成中藥某些成分的變性分解，導致產物的純度降低［12，13］。

1.3 超臨界CO2提取法

CO2是最常用的超臨界流體，原花青素中含有多羥基基團，而CO2屬于非極性溶劑，因此在提取原花青素過程中需加入一些極性夾帶劑，如水、乙醇、甲醇以及二氯甲烷等［14］。顏雪琴等［15］以乙醇為夾帶劑對石榴皮中的原花青素進行提取，在乙醇體積分數65%、料液比1.0∶1.3、CO2流速5 L/h、提取溫度48℃、提取壓力35 MPa條件下，試驗所得到原花青素的提取率可達3.40%。

1.4 輔助提取方法

1.4.1 超聲波輔助提取 超聲波可以加速對植物細胞壁的破壞，使細胞內的物質加速溶出，從而提高提取率。目前，國內外對原花青素的提取工藝較多，發現其研究集中在采用超聲波協同酶法、溶液提取法、機械研磨法等方面。有學者采用超聲波-乙醇法對山楂中原花青素進行了提取工藝研究，發現采用該方法時，山楂中原花青素的提取率可達1.781%［16］。有研究采用超聲-微波協同法對酒花殘渣中的原花青素進行提取，發現原花青素的提取率顯著高于超聲波提取法或微波提取法［17］。呂品等［18］首次將超聲波與酶解技術結合，對莽吉柿果殼中的原花青素進行提取，通過單因素及響應面試驗對工藝參數進行優化，其提取最佳工藝條件為纖維素酶用量2%、酶解時間68 min、酶解溫度58.5℃、超聲功率320 W、超聲時間20 min，結果發現，原花青素的提取率高于單獨使用超聲波和酶法提取。超聲波-機械研磨法是指在超聲波的基礎上，增加物理性外力，利用機械摩擦產生相應機械剪切力來破壞植物的組織結構，從而增加有效成分的溶出。程海濤等［19］利用超聲波-機械研磨協同法提取彩椒中原花青素，通過單因素試驗和響應面試驗優化提取工藝，最終原花青素的提取率可達6.211 mg/g。

1.4.2 微波輔助提取 在微波場中，不同物質吸收微波的能力不同，使得不同的物質被選擇性加熱，加速目標成分的溶出。微波輔助提取能顯著縮短提取時間，增加提取率。張兵兵等［20］采用微波-酶法對葡萄子中的原花青素進行提取，并且經過AB-8型大孔樹脂純化后，得到的原花青素純度為95.6%。容晨曦等［21］采用微波輔助法提取刺玫子中的原花青素，不僅顯著提高了原花青素的提取率，且縮短了提取時間和加熱時間。

2 原花青素的分離純化

植物中的化學成分復雜多樣，需要經過反復的分離、純化等過程才能提高目標成分的純度。目前，對于原花青素類化合物的純化，應用最多的方法有膜結合柱層析法、大孔樹脂柱層析法、聚酰胺柱層析法、高速逆流色譜法等。

2.1 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法，是利用吸附劑對樣品中各組分吸附能力的不同，從而達到分離的一種方法，其中最常用有的吸附劑有硅膠、大孔樹脂、聚酰胺等［22］。梁敏等［23］選擇5種大孔吸附樹脂對葡萄子原花青素進行純化，結果表明HPD400更適合葡萄子原花青素的分離與富集，純化后的原花青素含量可高達85%。聚酰胺中含有豐富的酰胺基團，酰胺基團可與化合物中的酚羥基形成氫鍵，由于形成氫鍵的數目、強度不同，聚酰胺對不同化合物的吸附能力也不同，利用不同梯度的甲醇或乙醇溶液進行洗脫，溶劑分子可與酰胺基團形成氫鍵，將化合物分子替換出來，從而達到分離的目的。聚酰胺柱層析主要用于黃酮類、多酚類化合物的分離純化。原花青素是一類以兒茶素或表兒茶素為結構單元的縮合多酚類化合物，分子上有豐富的酚羥基，可與酰胺基團形成氫鍵，因此，可以用聚酰胺對原花青素進行分離純化。呂麗爽等［24］通過聚酰胺柱層析法對葡萄子中的物質進行分離純化，得到純度較高且抗氧化性能優良的低聚花青素，純度可達到99%。紀秀鳳［25］先利用大孔樹脂對紅樹莓子中的原花青素進行初步分離純化，得到純度較低的原花青素初純物，再經聚酰胺二次純化，得到高純度低聚原花青素。

2.2 膜分離法

膜分離法是指采用具有選擇透過性的薄膜作為分離介質，在濃度差、壓力差或電位差的作用下使混合物中的組分選擇性地透過膜，從而達到分離的目的。利用膜分離法可以除去混合物中的大分子物質及膠體物質，如蛋白質、多糖、鞣質等?？刹捎媚し蛛x技術，根據聚合度不同將原花青素進行分離。陳文良等［26］采用此法從葡萄子中分離低聚原花青素，所得含量高達65%。張娣等［27］研究發現，采用PAN膜-大孔樹脂聯用分離純化蓮房原花青素，得到的原花青素純度在81%以上，高于直接進行大孔樹脂分離的63%。

2.3 高速逆流色譜

高速逆流色譜（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）結合了液-液萃取和分配色譜的特點，是一種連續高效的液-液分配色譜分離技術。王尉等［28］采用高速逆流色譜結合制備液相色譜法從葡萄子乙醇提取物中分離得到了8種多酚，其中原花青素B1、原花青素B2、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯和兒茶素的純度分別為98.5%、97.2%、98.3%、98.9%和96.7%。Zhang等［29］采用高速逆流色譜法，根據聚合度不同，有效地從葡萄子中分離出7個不同餾分的原花青素，其分離純度可高達95.7%。

3 原花青素的含量測定方法

通過查閱文獻發現，目前原花青素的含量測定方法主要有鹽酸-正丁醇法、香草醛法、DMAC法、高效液相色譜法。

3.1 鹽酸-正丁醇法

鹽酸-正丁醇法又叫鐵鹽催化法，是根據原花青素在酸性條件下加熱轉化為紅色的花青素，其顯色原理為在正丁醇的鹽酸溶液中，Fe3+為催化劑，在加熱的條件下，原花青素結構單元之間的C-C鍵斷裂，末端單元以黃烷-3-醇形式解離，延伸單元生成碳正離子并繼續失去質子生成黃烷-3烯-3醇，并被繼續氧化成在550 nm處有紫外吸收的花青素。該法具有專屬性，兒茶素、表兒茶素等結構單體在該條件下不顯色，可排除該類物質對顯色的干擾［30，31］。

3.2 香草醛法

香草醛法是目前使用最為廣泛的測定方法，其反應原理為在強酸作用下香草醛能與原花青素類物質A環上的間苯二酚或間苯三酚發生縮合反應，在濃酸作用下（鹽酸或硫酸）生成在500 nm處有紫外吸收的有色的正碳離子，吸光度與濃度在一定范圍內呈線性相關關系［32］。但是，該法不具專屬性，很多黃酮類化合物A環上也具有間苯二酚或間苯三酚結構，原花青素一般是多聚體，1個分子中有多個活潑的A環與香草醛結合，因此，以兒茶素為對照品采用該法所測得的結果高于實際值。

3.3 DMAC法

對-二甲基氨基肉桂醛（DMAC）法，其反應機理為DMAC在酸性條件下與黃烷醇發生脫水縮合，生成在640 nm處有紫外吸收的藍色產物，其顏色與濃度呈正比［33］。黃雪松等［34］以DMAC為顯色劑測定了山竹果皮、花萼和果肉中原花青素含量。該方法靈敏度比香草醛法高、速度快且專屬性強［35］。

3.4 高效液相色譜法

利用HPLC法測定反應后產物的含量，即可測定原花青素的含量［36］。黃文燁等［37］采用硫解衍生法和RP-HPLC法對山竹殼中可提原花青素（EP）和不可提原花青素（NEP）進行了測定，準確測出竹殼中原青素的組成單元、含量和平均聚合度。張璐等［38］通過RP-HPLC法同時測定原花青素中兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2的含量，結果表明該方法具有簡便、準確、重復性好的特點。

4 原花青素藥理活性

4.1 清除自由基及抗氧化活性

原花青素類物質是一種以兒茶素或表兒茶素為主要結構單元的多酚類聚合物，是一種天然的抗氧化劑，具有較強的抗氧化活性。據文獻記載，原花青素體內的抗氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍［39］。因為具有優異的抗氧化性能，被廣泛應用于醫藥衛生、保健品、化妝品等領域［40］。有研究發現，在體外抗氧化試驗中，山楂原花青素在一定劑量范圍內對羥基自由基、DPPH自由基的清除率及總抗氧化能力顯著高于維生素C，且抗氧化能力與濃度呈正相關［41］。研究發現，人體內產生過量的自由基是導致機體肝臟損傷、衰老及其他疾病產生的原因之一，葡萄子原花青素（GSPE）能夠通過提高機體內的抗氧化能力，抑制氧化應激作用來緩解糖尿病小鼠基本情況，緩解腎臟損害［42］。張勍等［43］研究發現，夏黑葡萄花青素可通過調節衰老小鼠體內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的活性，清除衰老小鼠心肌細胞中的自由基，保護衰老小鼠的心肌細胞。

4.2 抗炎

炎癥本身是機體對外源刺激的一種防御或免疫反應，但過度或持續性炎癥反應會引發多種炎癥相關性疾病。全帥等［44］研究發現，葡萄子低聚原花青素可以降低結腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平，上調Nrf2和HO-1蛋白的表達水平，上調結腸組織中SOD水平，下調MDA水平，從而改善小鼠潰瘍性結腸炎。有研究發現，原花青素對內毒素血癥小鼠具有保護作用，其作用機制可能與抑制NO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達有關［45］。王青等［46］研究發現，原花青素B1和B2均能抑制LPS誘導的BV-2細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，并能抑制NF-κB的磷酸化，且兩者作用強度無顯著差異。趙雅寧等［47］研究發現，葡萄子原花青素可減輕慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應，改善大鼠學習記憶能力，其作用機制可能與抑制大鼠腦組織內p38MAPK的活性和炎癥因子IL-1β的表達有關。

4.3 降血糖、降血脂

劉奇等［48］通過采用不同體積分數乙醇滲漉提取，經大孔樹脂層析，得到不同乙醇梯度葡萄子原花青素洗脫物，并采用高血脂大鼠模型對乙醇梯度洗脫物進行降血脂藥效部位篩選，發現50%乙醇洗脫物能明顯降低高血脂大鼠的谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）的含量，各乙醇梯度葡萄子原花青素洗脫物均可以促進甘油三酯的代謝，提高肝臟代謝功能，抑制體內脂質的大量沉積，抑制動脈粥樣硬化的發展，進而起到降血脂作用。胡濟美等［49］通過高脂模型小鼠試驗，對刺玫子原花青素進行降血脂研究，發現刺玫子原花青素高劑量組（200 mg/kg）可以顯著降低高脂小鼠血清內低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、甘油三酯含量，調節小鼠血脂代謝來達到降血脂的作用。劉靈等［50］研究發現，葡萄子原花青素能緩解血清胰島素抵抗水平、修復損傷的β細胞、調節β細胞的增殖和凋亡等方面來調節糖脂代謝，對2型糖尿病患者有明顯的降血糖、降血脂作用，且不會對肝腎及造血功能造成不良影響。此外，還有研究發現，原花青素還可以通過提高機體抗氧化能力、降低炎癥因子對胰島細胞的損傷，調節血清的甘油三脂、總膽固醇和高密度脂蛋白達到降血糖和改善血脂的作用，如龍眼核原花青素［51］、昆山雪菊原花青素［52］、葡萄子原花青素［53］、松樹皮原花青素［54］。

4.4 抗癌、抗腫瘤

原花青素對癌癥、腫瘤具有一定的預防和治療作用，其作用機制主要有抑制細胞生長，誘導腫瘤細胞死亡，調控分子信號通路NF-κB、MAPK、PI3K/AKT中的蛋白質［55］。郭方明等［56］研究發現，葡萄子中的提取物原花青素可以誘導人食管癌細胞凋亡，其作用機制與抑制NF-κB通路中相關蛋白、活化Bax從而抑制PGE2、CRP的產生有關。研究發現，原花青素B2可以通過下調PI3K/Akt通路中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表達誘導直腸癌細胞凋亡和自噬［57］。紅小豆中含有的原花青素，主要是兒茶素聚合物類組分對人體PC-3前列腺癌細胞具有顯著的抗癌活性，且他們還能通過抑制脂肪酸結合蛋白5基因的表達來控制前列腺癌細胞生長和轉移［58］。

5 小結與展望

現代研究發現，在健康狀態下，自由基是神經傳導和炎癥反應必不可少的重要介質，能夠增強機體的免疫力等作用。但是在病理狀態或外界環境的刺激下，多余的自由基會破壞人體細胞，造成機體的一系列損傷。據文獻記載，與自由基有關的疾病多達70余種［59］。雖然在健康狀態下，人體能通過超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、維生素C、維生素E等物質清除體內多余的氧自由基，維持體內氧自由基的平衡。但是隨著年齡的增長，體內這些物質就會相應減少。需要適當補充維生素C等抗氧化物質來維持機體氧自由基的平衡［60］。但是長期服用維生素C可能會對人體健康產生潛在的危害，因此，需要不斷發掘不同的天然抗氧化物質，開發各種類型抗氧化效果較好的產品。

當歸藤是廣西少數民族民間常用藥物，具有補血調經、活血止血、祛風止痛、舒經活絡等功效［61，62］。當歸藤中含有豐富的兒茶素、原花青素類成分，且含量較高。但是目前對于當歸藤原花青素的研究較少，由于當歸藤中原花青素的抗氧化能力強，極易在空氣中被氧化，給分離提取帶來較大的困難。可通過文獻調研，為當歸藤提取分離純化、抗氧化研究，補血活血相關研究提供研究思路和方法。