外周血樹突狀細胞Tim-3蛋白、CD80、CD86表達與骨髓增生異常綜合征預后的相關性

余娟，嚴曉琴，鄒夏，華芳

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一種或多種血細胞類型發育不良，以及骨髓譜系中細胞減少和功能異常的疾病[1]。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)可提供淋巴細胞活化、增殖的信號，在自身免疫監控、體液免疫應答中發揮重要作用[2]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)是一種由淋巴細胞亞型輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)、Th17、自然殺傷(natural killer，NK)細胞及髓系細胞表達的Ⅰ型跨膜蛋白[3]。現檢測MDS患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)誘導成熟的DC細胞Tim-3、CD80、CD86表達水平，分析其與MDS患者預后的相關性，以期為臨床防治MDS提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年11月—2017年11月于四川大學華西醫院血液內科就診的MDS患者104例作為研究對象(觀察組)，男59例，女45例，年齡53～76(61.17±7.35)歲；病程2.15～8.01(5.32±2.64)年；合并癥：糖尿病22例，慢性心力衰竭15例，肺炎19例；有家族遺傳病史32例，既往均無治療史。根據2016年世界衛生組織公布的MDS分型標準[4]進行分型：難治性貧血患者9例，難治性貧血伴環形鐵粒幼紅細胞增多患者13例，難治性貧血伴原始細胞增多Ⅰ型患者43例，難治性貧血伴原始細胞增多Ⅱ型患者32例，5q-綜合征7例。根據MDS國際預后評分系統(international prognostic scoring system，IPSS)[5]對104例患者進行預后分組，低危亞組(0分0.05)；與健康對照組比較，觀察組環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例、骨髓涂片原始細胞升高，Hb、PLT、RBC水平降低(P<0.01)，見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準(審批號：2015-07-257B)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組受試者臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①患者均符合“骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國專家共識(2014年版)”診斷標準[6]；② MDS患者持續4個月一系或多系血細胞減少(Hb<110 g/L，中性粒細胞絕對計數<1.5×109/L)；③臨床資料完整者。(2)排除標準：①患有其他可導致血細胞減少和發育異常的造血及非造血系統疾病；②伴隨嚴重肝腎功能不全或衰竭；③患有自身免疫性疾病(系統性紅斑狼瘡、風濕性關節炎等)；④患有骨轉移癌、肝癌、肺癌等腫瘤疾病等患者。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 外周血DC細胞培養：采集受試者肘靜脈血15 ml并抗凝，緩慢加入預先加有人淋巴細胞分離液(上海聯邁生物工程有限公司)5 ml的離心管中，室溫下離心，吸取中間層白色細胞至15 ml離心管，加入含20%胎牛血清(FBS，武漢普諾賽生命科技有限公司)的RPMI-1640培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司)5 ml，混勻，離心棄上清，加入紅細胞裂解液(上海聯邁生物工程有限公司)2 ml混勻1～2 min，離心棄上清；加入含10% FBS血清的RPMI-1640重懸計數鋪板，置于細胞培養箱培養5 h，細胞貼壁后棄去非貼壁細胞，加入含有重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF，上海江萊生物科技有限公司)20 μg/L和重組人白介素-4(rhIL-4，上海江萊生物科技有限公司)完全培養基20 μg/L培養，隔天半量換液，培養至第7 d。用倒置顯微鏡每天觀察細胞生長、形態及數量變化情況，并拍照。當看到細胞體積明顯變大，約為單個核細胞的三四倍，大部分細胞發生脫壁、懸浮，可見伸展的毛刺狀突起，為典型的DC細胞形態。

1.3.2 流式細胞儀檢測DC細胞CD80、CD86含量:使用0.5%乙二胺四乙酸消化DC細胞，離心收集細胞，加入流式細胞緩沖液100 μl重懸細胞，加入PE標記抗人-CD11c/CD80抗體(英國Abcam公司)2.5 μl，FITC標記抗人-MHC-Ⅱ/CD86抗體(英國Abcam公司)2 μl，冰上放置30 min，避光染色，中間混勻1次，加入染色緩存液1 ml，終止染色，離心收集細胞，加入PBS重懸細胞200 μl，過篩網后上流式細胞儀(上海然哲儀器設備有限公司，型號NovoCyt)檢測，用標記的百分率表示其含量。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測Tim-3蛋白表達水平:收集培養的DC細胞，加入細胞裂解液500 μl，冰浴30 min，離心30 min后吸取上清至EP管。用BCA法(試劑盒購自美國賽默飛公司)測定全細胞裂解液蛋白濃度，每孔取40 μg進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗(Tim-3、GAPDH，英國Abcam公司)均1∶1 000孵育4℃過夜，羊抗人二抗(英國Abcam公司)1∶10 000室溫孵育2 h，增強化學發光顯色，以Quantlty One軟件分析其灰度值。

1.4 隨訪 通過門診復查或打電話的方式對患者進行為期3年的隨訪，隨訪起始時間為收治患者入院之日，隨訪截止時間為患者死亡或到截止日期，記錄患者3年內生存率。

2 結 果

2.1 2組外周血PBMC誘導成熟DC細胞比例比較 觀察組外周血PBMC誘導成熟DC細胞的平均比例為(71.56±9.14)%，顯著高于健康對照組的(44.13±7.46)%，差異有統計學意義(t=18.461，P=0.000)，見圖1。

2.2 2組DC細胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86比例比較 與健康對照組比較，觀察組外周血PBMC誘導成熟DC細胞中Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例均升高(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 2組受試者外周血PBMC誘導成熟DC細胞中Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例比較

2.3 各亞組MDS患者DC細胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86比例比較 低危亞組、中危亞組、高危亞組DC細胞中Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例依次升高(P均<0.01)，見表3。

注：PBMC.外周血單個核細胞；DC.樹突狀細胞；Tim-3.T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3；GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶圖2 2組外周血PBMC誘導成熟DC細胞中Tim-3蛋白表達印跡圖

表3 各亞組MDS患者外周血PBMC誘導成熟DC細胞中Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例比較

2.4 DC細胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86分別與MDS患者骨髓指標相關性分析 MDS患者DC細胞中Tim-3蛋白分別與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例、骨髓涂片原始細胞呈正相關(P<0.05)，與PLT、RBC呈負相關(P<0.05)；CD80與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例、骨髓涂片原始細胞呈正相關(P<0.01)，與PLT呈負相關(P<0.01)；CD86與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例呈正相關(P<0.01)，見表4。

表4 DC細胞中Tim-3蛋白及CD80、CD86分別與MDS患者骨髓指標相關性分析

2.5 各亞組MDS患者生存率比較 MDS患者3年累積生存率比較，低危亞組(91.67%，44/48)高于中危亞組(70.97%，22/31)高于高危亞組(36.00%，9/25)，差異有統計學意義(χ2=25.360，P=0.000)，見圖3。

注：MDS.骨髓增生異常綜合征圖3 各亞組MDS患者生存率比較

2.6 影響MDS患者預后的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示，Tim-3蛋白、CD80、CD86水平升高是MDS患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響MDS患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

MDS作為一組克隆性造血干細胞疾病，其特征在于無效的造血功能導致血細胞減少，并具有發展為急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的風險[7-9]。當干細胞受損導致子代血液細胞發生復雜變化，包括細胞分化、增殖/成熟缺陷時，MDS就會啟動[10]。在過去的幾十年中，對MDS的認識和治療迅速發展，病理生物學的主要部分已被闡明，一些診斷和預后判斷的工具得到實施，新的治療方法被發現。但是MDS仍然是一種具有廣泛異質性和不明確診斷的疾病，臨床對MDS的診斷確定性，患者是否有AML轉化或骨髓衰竭的危險均不可知，因此，對MDS的發病機制及其預后影響因素進行研究，可能有助于臨床醫生對MDS的防治。

流式細胞術免疫表型分析可以識別異常增加或減少的良性及惡性漿細胞數量，以及成熟或不成熟譜系標記的異常表達，因此，流式細胞術已經成為MDS診斷、預后和檢測病程的重要工具[11]。DC細胞作為天然免疫和適應性免疫之間的橋梁，在識別病原體和激活B、T淋巴細胞方面起著至關重要的作用。郭含夢等[12]發現，與正常人比較，MDS患者白介素-17、白介素-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等多種細胞因子水平升高，猜測MDS患者可能存在DC細胞含量增加，并促進細胞因子的分泌。本研究發現，MDS患者外周血PBMC誘導成熟DC細胞的平均比例高于健康對照組，提示MDS患者外周血DC可能參與了MDS的病理變化。MDS患者的造血功能可通過改變抗原表達、細胞亞群頻率和散射特性而與正常人不同。免疫表型改變在MDS患者的診斷、危險分層和治療指導方面已被證明有應用價值[13]。Tim-3是TIM家族蛋白成員，編碼基因位于人類染色體帶5q33.2上，在分泌IFN-γ、CD8+T細胞、DC和巨噬細胞等的CD4+T細胞中表達[14-15]。因此，Tim-3的治療靶向可能通過作用于多種細胞類型來調節免疫反應。王方方等[16]發現，MDS患者Tim-3表達水平可能參與MDS的發病，并可能成為臨床鑒別再生障礙性貧血與MDS的標志物。CD80是CD86活化T淋巴細胞時的協同刺激因子，在自身免疫監控、體液免疫應答及移植反應中發揮重要作用[17-18]。Tcvetkov等[19]在對55例MDS患者的3年隨訪中發現，CD80高表達患者中有72.9%的患者疾病發生了惡化，而CD80低表達患者有52.1%發生了惡化，差異顯著。本研究發現，與健康對照組比較，觀察組外周血PBMC誘導成熟DC細胞Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例均升高；與低危亞組比較，中危亞組、高危亞組DC細胞Tim-3蛋白表達水平及CD80、CD86比例也依次升高，提示高表達的Tim-3、CD80、CD86可能與MDS的發生發展有關，與姚丹丹等[20]研究結果一致。本研究結果還顯示，MDS患者DC細胞中Tim-3蛋白分別與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例、骨髓涂片原始細胞呈正相關，與PLT、RBC呈負相關；而CD80與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例、骨髓涂片原始細胞呈正相關，與PLT呈負相關；CD86與環狀鐵粒幼紅細胞占有核紅細胞比例呈正相關，此結果說明Tim-3、CD80、CD86與MDS患者骨髓指標均有一定的相關性，進一步說明Tim-3、CD80、CD86可能是影響MDS發生發展的因素。本研究結果也顯示，低危亞組、中危亞組、高危亞組MDS患者3年累積生存率依次降低。提示IPSS評分越高生存率越低，可能與Tim-3、CD80、CD86的異常高表達有關。進一步經多因素Logistic回歸分析顯示，Tim-3蛋白、CD80、CD86水平升高是MDS患者不良預后的獨立危險因素，提示Tim-3、CD80、CD86異常表達與MDS的預后有關，猜測可能是Tim-3、CD80、CD86異常表達導致DC細胞免疫功能障礙，不能有效地遞呈抗原給T淋巴細胞和B淋巴細胞，因而造成機體功能免疫紊亂，可能作為潛在的臨床治療靶標。

綜上所述，MDS患者外周血PBMC誘導成熟DC細胞比例及DC細胞中Tim-3蛋白、CD80、CD86水平均升高，與MDS患者預后不良有關，可能作為潛在的防治靶標。本研究未對MDS患者炎性反應水平進行檢測分析，下一步可以結合MDS患者炎性反應水平探究Tim-3蛋白、CD80、CD86水平與MDS的相關性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

余娟：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；嚴曉琴：提出研究思路，課題設計，分析試驗數據，論文審核；鄒夏：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；華芳：收集資料和修改論文，進行統計學分析