重癥急性胰腺炎外周血miR-9、miR-155表達水平與淀粉酶、炎性反應及Th17/Treg平衡的關系

趙瑞臣,次多,何春婭,胡佳佳,李素芝，馮東方

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是急診科常見病，其病理過程為胰酶在胰腺內被激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎性反應，具體病因迄今尚不十分明確，多認為與過量飲酒、膽結石、膽道感染等有關[1-2]。根據“中國急性胰腺炎診治指南”[3]可將AP分為輕度AP(mild acute pancreatitis，MAP)、中度AP(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)和重度AP(severe acute pancreatitis，SAP)。在預后方面，雖然大部分輕度AP患者為自限性疾病，預后良好，但仍有近1/5會轉為MSAP或SAP。SAP病情進展較快，并發癥多，治療難度大，病死率居高不下，嚴重威脅患者的生命安全。有研究表明[4]，當胰腺受到損傷時，胰腺泡細胞釋放微小核糖核酸(microRNA，miR)，并在外周血中穩定表達。另有研究表明[5-6]，miR-9、miR-155在胰腺損傷中異常表達，提示miR-9、miR-155可能在SAP的病理過程中發揮了重要作用。現分析SAP患者外周血中miR-9、miR-155的表達及其與血清淀粉酶(serum amylase，S-amy)、炎性反應、輔助性T細胞17(helper T cells 17，Th17)/調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)平衡的關系，以期為SAP診療提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月—2020年5月中國人民解放軍西藏軍區總醫院急診醫學科收治AP患者294例(病例組)及同期在醫院進行體檢的健康者51例(健康對照組)為研究對象。根據“中國急性胰腺炎診治指南”[3]中的分類標準，其中重度AP患者39例為SAP亞組，中度AP患者97例為MSAP亞組，輕度AP患者158例為MAP亞組。SAP亞組男26例，女13例，年齡18～71(45.73±7.26)歲；發病至入院時間4～9(6.23±1.86)h；基礎疾病：高血壓11例，糖尿病3例；病因：高脂血癥性12例，膽源性18例，酒精性5例，特發性4例。MSAP亞組男66例，女31例，年齡19～75(46.57±7.79)歲；發病至入院時間4～10(6.29±1.72)h；基礎疾病：高血壓28例，糖尿病5例；病因：高脂血癥性33例，膽源性41例，酒精性12例，特發性11例。MAP亞組男105例，女53例，年齡19～76(46.64±7.81)歲；發病至入院時間4～9(6.27±1.78)h；基礎疾病：高血壓27例，糖尿病7例；病因：高脂血癥性49例，膽源性73例，酒精性20例，特發性16例。健康對照組男34例，女17例，年齡18～70(44.85±7.06)歲。4組對象的性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。3亞組發病至入院時間、基礎疾病、病因構成比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核批準(審批號：YZJQZYYLS20150109)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 入組選擇標準 (1)納入標準：①AP患者經腹部超聲及腹部增強CT檢查，符合AP的臨床診斷標準[3]，患者胰腺形態改變，存在明顯的腹痛、腹脹、惡心、嘔吐等表現；年齡≥18歲，均為首次確診；②健康對照組經肝功能、血尿常規、心電圖、X線胸片等檢查顯示無異常者。(2)排除標準：①伴有肝炎、皰疹病毒感染者；②患惡性腫瘤及自身免疫性疾病者；③患有其他嚴重器質性病變者；④入組前1個月內服用過可能影響炎性指標、Treg、Th17水平的藥物者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血標本采集：AP患者于確診后(治療前)及健康對照組于體檢當日采集清晨空腹外周血8 ml，均分為4份，每份2 ml，按相關規程保存待檢。

1.3.2 外周血miR-9、miR-155水平檢測：血樣本2 ml離心獲取血清，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測血清miR-9和miR-155表達量。血清在無菌無RNA酶條件下采用TRI Reagent BD試劑(美國Gene Copeia公司)提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，用紫外分光光度計NanoDrop2000c(美國賽默飛世爾公司)檢測RNA濃度，樣品吸光度(A230/280)值在1.8～2.0保存待測。采用RT反轉錄試劑盒(美國Gene Copeia公司)進行RNA逆轉錄，將RNA逆轉錄為cDNA，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。miR-9和miR-155定量檢測采用U6為內參基因，U6上游引物序列為5'-AGCGGGAACGTGCGTGACA-3'，U6下游引物序列為5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3'；miR-9上游引物序列為5'-GCGTCTITGGTTATCTAGCTGTA-3'，下游為5'-GCATGCTCATGAGCATCG’-3'；miR-155上游引物序列為5'-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3'。下游為5'-CATCACAGACCTGTTATTGC-3'。RT-qPCR反應體系總體積20 μl，RT-qPCR反應條件為：94℃預變性2 min，95℃變性30 s，95℃退火3 s，60 ℃延長30 s，共進行40個循環。miR-9和miR-155的相對表達量用2-△△CT法計算[7]。

1.3.3 血清炎性指標及淀粉酶檢測：上述血樣本2 ml離心獲取血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定白介素6(IL-6)、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)水平，試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；另取血樣本2 ml離心獲取血清采用酶速率法(37℃)檢測S-amy水平，試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 Th17、Treg水平檢測：取肝素鈉抗凝的外周血2 ml，常規分離外周血單個核細胞并提純，調整細胞濃度為1×106/ml，取1 ml加入流式細胞檢測專用試管，離心棄上清后加入磷酸鹽緩沖液100 μl，加入CD4單克隆抗體、CD25單克隆抗體、CD127單克隆抗體各20 μl，抗體與細胞懸浮液混勻，在室溫下避光孵育20 min，再次加入磷酸鹽緩沖液2 ml，混勻后再離心棄上清，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液重懸浮細胞，混勻后避光放置，以流式細胞儀檢測Treg。用于檢測Th17的樣本加入濃度為1 μl/ml的佛波酯(美國Sigma公司)0.5 μl，在37℃溫箱中培養1 h，再加入蛋白逆轉抑制劑2 μl，在37℃溫箱中培養3 h，加入磷酸鹽緩沖液2 ml洗滌，混勻后離心棄上清后加入CD4單克隆抗體30 μl，于4℃下避光孵育15 min，加入IL-17抗體5 μl，混勻后在4℃下避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液2 ml，混勻棄上清，再加入磷酸鹽緩沖液重懸浮細胞0.5 ml，以流式細胞儀檢測Th17。Th17、Treg檢測結果以陽性細胞百分數表示，并計算Th17/Treg比值。

2 結 果

2.1 各組miR-9、miR-155表達水平比較 外周血中miR-9、miR-155表達水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組外周血miR-9、miR-155相對表達量比較

2.2 各組血清炎性指標及S-amy水平比較 血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、S-amy水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組血清炎性指標及S-amy水平比較

2.3 各組Th17、Treg水平比較 Th17水平、Th17/Treg比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；Treg水平比較，SAP亞組

表3 各組Th17、Treg水平比較

2.4 miR-9、miR-155與炎性指標、Th17、Treg、S-amy的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，外周血中miR-9、miR-155表達與IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、Th17、Th17/Treg、S-amy呈正相關(P<0.05)，與Treg呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 miR-9、miR-155與炎性指標、Th17、Treg、S-amy相關性分析結果

3 討 論

目前關于AP的發病機制尚不十分明確，多數學者認為是炎性細胞(如內皮細胞、淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等)、炎性因子(如TNF-α、轉化生長因子β1、白介素、血小板激活因子等)之間相互作用從而產生級聯瀑布反應，進而引發全身性炎性反應，造成AP的早期病理損害[8-10]。IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，可調節免疫應答，是重要的炎性指標之一。IL-8屬于趨化因子家族的細胞因子，IL-8結合IL-8受體α和受體β對中性粒細胞有細胞趨化作用，實現其對炎性反應的調節功能。TNF-α是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，參與炎性反應和免疫反應過程。CRP是一種經典的急性時相蛋白，其本身直接參與了炎性反應過程，是一種非特異的炎性標志物。湯偉勝等[11]研究顯示，SAP患者血清炎性指標(IL-6、IL-8、IL-10、CPR)水平升高。張婷婷等[12]的研究表明，TLR4信號通路作為炎性反應的閘門，通過一系列信號轉導調控炎性介質的釋放，引起SAP患者各器官損傷。Matsuda等[13]的研究也表明，炎性反應與AP病情密切相關。本研究中，IL-6、IL-8、TNF-α、CRP的表達水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>健康對照組，表明AP患者機體存在炎性反應，且炎性反應水平與病情程度有關。在正常機體狀態下，炎性因子與炎性細胞保持動態平衡，在AP病理過程中，會發生促炎—抑炎之間的失衡，從而打破原有的動態平衡，機體狀態向促炎一方極化，引發機體多個器官受損[14]。

Th17細胞通過分泌IL-17參與炎性反應的過程，IL-17可激活免疫T細胞活性，產生化學增活素、細胞黏附分子等，從而介導炎性反應發生[15]。Treg細胞是CD4+T細胞亞群之一，其主要分泌特異性表達叉狀頭轉錄因子，具有免疫抑制作用，通過分泌IL-10、IL-4等細胞因子維持體內免疫環境的穩定[16]。Th17細胞和Treg細胞的分化過程是相互拮抗的，在正常機體狀態下，二者通過免疫網絡保持抗炎—抑炎平衡，當機體損傷時，抗炎—抑炎的平衡被打破，對機體免疫起負調節作用[17]。本研究顯示，Th17細胞、Th17/Treg水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對照組；Treg水平比較，SAP亞組

miRNA是一類由21～25個核苷酸組成的非編碼小分子核糖核酸，其生物學功能是參與細胞增殖、分化、凋亡、激素調節和新陳代謝等過程[20]。目前有研究[21]證實，miRNA與腫瘤、心血管病、腦血管病等多種疾病有關，miRNA通過特定的細胞因子和信號通路對Th17和Treg細胞的分化進行調節，并在分子水平上介導Th17與Treg細胞的平衡，參與免疫應答的過程。但目前關于miR-9、miR-155與SAP關系的研究較少。本研究發現，外周血中miR-9、miR-155的表達水平比較，健康對照組MSAP亞組>MAP亞組>健康對照組，表明AP患者血清淀粉酶升高，這一觀點在以往研究中也得到證實[24-25]。進一步的相關性分析結果顯示，外周血中miR-9、miR-155的相對表達量與IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、Th17細胞、Th17/Treg、S-amy的表達水平呈正相關，與Treg細胞水平呈負相關。其機制可能是：每個miRNA可以調節不同的轉錄因子，一個靶基因也可以被幾個miRNA同時調節，miR-9、miR-155通過靶基因信號轉導抑制蛋白1、Smad2 分別正負向調控Stat3通路和Smad通路，從而調控Th17和Treg細胞的表達水平，影響炎性反應與免疫應答[26]。表明miR-9、miR-155可能通過影響炎性反應、免疫平衡和淀粉酶的釋放參與SAP的病理過程。

本結果表明，SAP患者外周血中miR-9、miR-155表達與血清淀粉酶、炎性指標水平及Th17/Treg平衡有關，但只是初步分析相關性，今后可從細胞株、動物實驗分析miR-9、miR-155與SAP病理過程的關系及具體機制，并探究二者對SAP的臨床診斷價值。

綜上所述，SAP患者外周血miR-9、miR-155表達上調，其可能通過影響炎性反應、免疫平衡、淀粉酶參與AP的病理變化過程，檢測外周血miR-9、miR-155表達水平對SAP的診療具有一定意義，可進行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙瑞臣：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；次多、何春婭：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；胡佳佳、李素芝：進行統計學分析；馮東方：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核