老年重癥急性胰腺炎合并應(yīng)激性高血糖患者血清miR-223、HMGB1檢測及意義

金旭，包先麗，張春芳，楊科

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種病情嚴重、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，占全部急性胰腺炎的10%～20%。SAP發(fā)生時，機體處于應(yīng)激狀態(tài)，伴發(fā)高代謝、胰島素抵抗及胰腺功能紊亂等，患者易出現(xiàn)應(yīng)激性高血糖[1]。隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(miRNA)在各個疾病中發(fā)揮重要作用。多項基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-223(miR-223)通過多種通路參與小鼠炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，且與病情嚴重程度有關(guān)[2-3]；另有報道稱miR-223在胰腺癌患者血清中表達上調(diào)，提高了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。然而關(guān)于miR-223在胰腺炎中的研究國內(nèi)外鮮見報道。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一組序列高度保守的核蛋白，分布于機體各重要器官組織中，作為一種晚期炎性介質(zhì)，參與機體炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，已有研究報道其在急性胰腺炎、慢性腎衰竭血透、膿毒癥等中發(fā)揮重要作用[5-7]。但二者在SAP合并應(yīng)激性高血糖患者中的表達情況，尚未有報道。因此，現(xiàn)分析合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月—2020年9月于北京市和平里醫(yī)院急診科診治的老年SAP患者108例為研究對象，男62例，女46例，年齡60～81(71.18±3.84)歲。以入院后24 h空腹血糖(FPG)水平≥6.9 mmol/L診斷為應(yīng)激性高血糖[8]，并據(jù)此分為合并應(yīng)激性高血糖組(高血糖組)57例，正常血糖組51例。2組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平、病因、家族史比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高血糖組患者急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[9]、FPG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著高于正常血糖組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(審批號：2017-P2-07-09)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組老年SAP患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①所有患者均符合“中國急性胰腺炎診治指南(2019年,沈陽)”[10]中有關(guān)SAP的診斷標準；首次發(fā)病且病程≤2 d；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病；②合并糖尿病患者；③近1個月服用過對血清生化指標有影響的藥物患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-223水平檢測：入院后抽取患者晨起空腹肘靜脈血5 ml，離心將上層清液移至干凈EP管，-20 ℃冰箱保存待測。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測血清miR-223水平。將血清先以TRIzol試劑(美國Sigma公司)提取總RNA，測定其濃度和純度，以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.0判斷為純度較好。使用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR擴增試劑盒(美國Thermo Scientific公司)進行相關(guān)反應(yīng)。miR-223以U6為內(nèi)參，由上海生工生物工程公司合成。miR-223上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTC-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGGTCGTGGAGTCGGCAA-3’；U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATATA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTG-3’。循環(huán)參數(shù)：95 ℃孵育10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，72 ℃延長10 min。用2-△△Ct法計算miR-223水平。

1.3.2 血清HMGB1水平檢測：上述血清利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清HMGB1水平(試劑盒購自北京百奧萊博生物科技有限公司)，檢測方法按照說明書步驟進行。

1.3.3 預后情況：治療后，患者癥狀恢復正常或與治療前相比，機體功能大幅改善為預后良好；患者癥狀無明顯改善或者加重，甚至死亡為預后不良。

1.4 病情判定 根據(jù)患者進入ICU或手術(shù)情況進行APACHE Ⅱ評分，分值越高提示病情越嚴重[9]。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-223、HMGB1水平比較 合并應(yīng)激性高血糖組患者血清miR-223、HMGB1水平均顯著高于正常血糖組(P<0.01)，見表2。

表2 2組老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.2 高血糖組預后情況 合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者經(jīng)治療后根據(jù)各項實驗室指標及癥狀恢復情況分為預后良好亞組26例和預后不良亞組31例，預后不良亞組APACHE Ⅱ評分為(16.73±5.27)分，高于預后良好亞組的(11.53±5.21)分，差異有統(tǒng)計學意義(t/P=3.730/0.000)。

2.3 2亞組患者血清miR-223、HMGB1水平比較 預后不良亞組患者血清miR-223、HMGB1水平高于預后良好亞組(P<0.01)，見表3。

表3 2亞組合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.4 血清miR-223、HMGB1對合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-223、HMGB1預測合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的曲線下面積(AUC)分別為0.881(95%CI0.768～0.952)、0.911(95%CI0.805～0.960)，敏感度分別為77.42%、80.65%，特異度分別為88.46%、96.15%，二者聯(lián)合診斷的AUC為0.952(95%CI0.860～0.971)，敏感度和特異度分別為93.55%、88.46%，見圖1、表4。

表4 血清miR-223、HMGB1對合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的診斷價值比較

2.5 影響合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的危險因素分析 以合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預后情況為因變量，以血清miR-223、HMGB1水平及APACHE Ⅱ評分為自變量進行多因素Logistic分析，結(jié)果顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平及高APACHE Ⅱ評分是影響合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預后不良的危險因素，見表5。

表5 影響合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的危險因素分析

注：SAP.重癥急性胰腺炎；miR-223.微小RNA-223；HMGB1.高遷移率族蛋白1圖1 血清miR-223、HMGB1預測合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的ROC曲線

3 討 論

SAP患者并發(fā)應(yīng)激性高血糖是一種臨床常見癥狀，導致SAP患者血糖升高的可能原因為患者在應(yīng)激狀態(tài)下胰島B細胞功能被破壞，胰島素分泌量減少，分解血糖減少，患者效應(yīng)細胞受體下調(diào)，產(chǎn)生胰島素抵抗，導致血糖水平上升。臨床研究發(fā)現(xiàn)，有60%左右行外科大手術(shù)的患者發(fā)生血糖升高[11]，高血糖提示胰腺功能不全，在急性胰腺炎期間或之后更容易發(fā)生。加強SAP患者術(shù)后監(jiān)護及血糖控制，對減少感染、改善預后具有重要意義。

miRNAs是一類長度約為22個氨基酸的非編碼單鏈RNA分子，由內(nèi)源性基因編碼，在細胞中調(diào)控基因表達發(fā)揮生理作用[12]。miRNAs表達紊亂通常與疾病發(fā)展的各個病理過程有關(guān)。Guan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠小膠質(zhì)細胞受損后，miR-223-5p水平在1周內(nèi)顯著上升，在第3天達到高峰，而相應(yīng)抑制劑可明顯降低miR-223-5p蛋白表達，提示抑制miR-223-5p表達可減輕脊髓受損后的炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，合并應(yīng)激性高血糖組老年SAP患者血清miR-223水平顯著高于正常血糖組，且合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者中預后不良亞組血清miR-223水平高于預后良好亞組，提示血清miR-223可能參與合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者病情的發(fā)生發(fā)展，其水平高表達可能是導致患者預后不良的原因。結(jié)合Guan等[13]研究可知，靶向抑制miR-223表達可能是治療SAP的潛在有效方法。隨著對急性胰腺炎的深入研究，細胞因子在SAP發(fā)展中的作用越來越受到重視[14-15]。巨噬細胞介導的炎性反應(yīng)是一種強有力的生物反應(yīng)，通過消除有害物質(zhì)在維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[16]。另有學者研究報道稱[17]，Kruppel樣因子6基因在分子水平通過占據(jù)巨噬細胞啟動子區(qū)直接抑制miR-223的表達來促進炎性反應(yīng)，發(fā)揮毒性作用。由此推測miR-223可能通過調(diào)控炎性介質(zhì)活化或通路激活，參與SAP的發(fā)生發(fā)展，具體作用機制有待進一步研究。

本結(jié)果顯示，合并應(yīng)激性高血糖組老年SAP患者血清HMGB1水平顯著高于正常血糖組，且合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者中預后不良亞組血清HMGB1水平高于預后良好亞組，提示血清HMGB1參與SAP患者炎性反應(yīng)損害過程，其表達水平越高患者病情越嚴重，預后越差。分析其原因，HMGB1是SAP患者全身性炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，發(fā)生SAP時，HMGB1被主動釋放到胞外進入外循環(huán)，與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體特異性結(jié)合傳遞胞內(nèi)信號，介導細胞反應(yīng)，如釋放促炎因子、激活炎性反應(yīng)等[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，SAP患者腸黏膜通透性增加，屏障功能受損，細菌侵襲作用增強，使胰腺組織發(fā)生繼發(fā)性感染，進一步刺激活化單核巨噬細胞分泌炎性介質(zhì)如白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，而TNF-α是導致全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的直接原因[20-22]。由于HMGB1晚于TNF-α、IL-6等早期炎性因子出現(xiàn)，并且持續(xù)時間較長，故稱之為晚期炎性因子，多項研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在心肌細胞再灌注損傷、血腦屏障功能障礙等重要組織器官病變中發(fā)揮作用[23-25]。由此推測，在HMGB1大量合成分泌之前，機體就處于炎性浸潤狀態(tài)，及早治療是改善SAP患者預后的有效方法。ROC分析結(jié)果顯示，血清miR-223、HMGB1預測合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預后不良的AUC分別為0.881、0.911，二者聯(lián)合檢測的AUC為0.952，提示血清miR-223、HMGB1對患者預后均有一定的預測價值，聯(lián)合檢測的診斷效能更好。進一步Logistic分析顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平、高APACHE Ⅱ評分均是影響合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預后不良的危險因素，提示在校正APACHE Ⅱ評分后，血清miR-223、HMGB1水平仍然與合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預后密切相關(guān)。

綜上所述，合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1呈高表達，血清miR-223、HMGB1水平升高與患者預后不良密切相關(guān)，提示監(jiān)測合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1對判斷患者病情發(fā)展、改善患者預后具有一定的臨床意義。但SAP患者伴發(fā)血糖升高是個復雜的過程，血清miR-223、HMGB1在SAP腸道黏膜屏障損傷、血糖升高中的具體作用機制仍未明確，有待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

金旭：設(shè)計研究方案，實施研究過程，課題設(shè)計，論文撰寫；包先麗：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；張春芳：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；楊科：進行統(tǒng)計學分析