基于連續(xù)分類策略的飼用魚油摻假陸生動物油脂紅外光譜鑒別分析

高 冰，徐 帥，韓魯佳，劉 賢

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083

引 言

農(nóng)業(yè)部第1773號公告《飼料原料目錄》將動物油脂列入了飼料原料目錄，作為飼料中重要的能量物質(zhì)被廣泛添加在各類畜禽飼料中[1]。目前，市場上常見的飼用動物油脂為魚油、 豬脂、 牛脂和家禽油脂。其中魚油的營養(yǎng)價值高、 產(chǎn)量低、 提煉工藝復(fù)雜[2]，因此魚油的價格高于其他飼用動物油脂。受利益驅(qū)使，市面上魚油的摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重，其中陸生動物油脂是魚油中常見的摻假物質(zhì)[3]。飼用魚油摻偽陸生動物油脂的行為不僅擾亂市場，嚴(yán)重?fù)p害消費者的權(quán)益，反芻動物油脂摻假更可能導(dǎo)致“瘋牛病”隨著養(yǎng)殖環(huán)節(jié)傳播[4]。

目前，國內(nèi)外常用的油脂摻偽檢測技術(shù)為基于脂肪酸組分檢測的氣相色譜法[5]。該方法雖能對樣品化學(xué)組分進(jìn)行直接檢測，但操作費時費力，對操作人員有嚴(yán)格的技術(shù)要求，不適合大樣本量的檢測[6]。與之相比，光譜法具有無需樣品預(yù)處理、 兼顧檢測精度與檢測效率等優(yōu)點，符合現(xiàn)階段產(chǎn)業(yè)的需求。有研究表明，光譜法可以運用于魚油的摻假鑒別[7]。Bellorini等利用FTIR光譜技術(shù)檢測魚油中的牛脂摻假[8]； Rohman等利用光譜法鑒別魚肝油中的豬脂、 牛脂和羊脂的摻假[9]； Xu等開展了魚油中單類別陸生動物油脂摻假紅外光譜判別分析的可行性研究，并探討了魚油中陸生動物油脂的檢出限[10]。以上研究均對魚油與摻假陸生動物油脂魚油之間進(jìn)行單類別判別分析，并未對多類別判別的可行性與效果進(jìn)行探討。

多類別判別分析方法廣泛應(yīng)用于油脂[11]、 飼料[12]、 葡萄酒[13]等食品的真實性和摻假研究。與多類別判別分析方法可以確證特定的摻假物不同，單類別判別分析只能篩查樣本是否為摻假樣本[14]。因此，單類別判別分析模型常應(yīng)用于大樣本量的快速篩選[15]。

本研究提出一種連續(xù)分類策略(單類別判別分析篩查+多類別判別分析確證)探究飼用魚油中摻假陸生動物油脂的紅外光譜鑒別分析潛力。

1 實驗部分

1.1 動物油脂樣品的收集與制備

供試動物油脂樣品共50個，包括魚油12個、 豬脂10個、 雞油9個、 牛脂10個和羊脂9個，收集自全國不同的飼用油脂企業(yè)。樣品均經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測，無交叉污染。

采用均勻混合法進(jìn)行飼用魚油中摻加陸生動物油脂的樣品制備，獲得摻假豬脂的魚油樣品40個，豬脂含量(W/W)范圍： 2.9%～49.4%； 摻假雞油的魚油樣品40個，雞油含量(W/W)范圍： 3.1%～51.3%； 摻假牛脂的魚油樣品40個，牛脂含量(W/W)范圍： 2.8%～50.6%； 摻假羊脂的魚油樣品40個，羊脂含量(W/W)范圍： 2.9%～50.3%。樣品總計160個。

1.2 紅外光譜數(shù)據(jù)分析

紅外光譜儀Perkin Elmer FTIR Spectrum 400(美國Perkin Elmer公司)，采用衰減全反射附件。光譜采集范圍為4 000～550 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32，每個樣品重復(fù)掃描3次取平均光譜。使用SNV，Smoothing，Autoscale等方法預(yù)處理光譜數(shù)據(jù)。

1.3 分析方法

采用主成分分析(PCA)進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)分類探索性分析。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進(jìn)行定性判別分析。所用軟件為Matlab(R2015a，美國Mathworks公司)。采用殘差統(tǒng)計剔除異常值，置信區(qū)間設(shè)為95%。為防止過擬合，使用“l(fā)eave one out”法進(jìn)行交互驗證[16]。通過Hotelling T2和Q殘差值進(jìn)行異常樣本的剔除。以識別率、 拒絕率和誤判率作為判別模型的評價指標(biāo)，其中識別率和拒絕率越接近1，誤判率越接近0，說明判別分析效果越好[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分分析

采用PCA對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析，如圖1所示，前兩個主成分分別占總變異系數(shù)的62.54%和12.41%。可以看出，純魚油和摻假陸生動物油脂魚油之間得到了較好的區(qū)分，不存在相互混雜的樣品； 摻假反芻動物油脂的魚油樣品主要分布在第二主成分的正方向，牛脂和羊脂摻假樣品相互混雜，區(qū)分效果差； 摻假非反芻動物油脂的魚油樣品主要分布在第二主成分的負(fù)方向，同樣可以看到豬脂和雞油摻假樣品相互混雜，區(qū)分效果差； 反芻動物油脂摻假樣品和非反芻動物油脂摻假樣品之間雖有少量的重疊，總體上區(qū)分較為明顯。

2.2 單類別摻假魚油判別分析

建立魚油中是否摻假陸生動物油脂的單類別PLS-DA判別模型，圖2為摻假陸生動物油脂魚油單類別預(yù)測結(jié)果。結(jié)果表明，純樣品和摻假樣品的識別率和拒絕率均為100.00%。OC-PLS分析結(jié)果同樣表明純樣品和摻假樣品的識別率和拒絕率均為100.00%。說明中紅外光譜技術(shù)可以準(zhǔn)確判別純魚油和摻假陸生動物油脂魚油，可作為快速工具應(yīng)用于魚油樣品是否摻假陸生動物油脂的篩查。

圖1 基于純魚油和摻假陸生動物油脂魚油紅外光譜的主成分得分圖

圖2 單類別PLS-DA判別模型結(jié)果Fig.2 Results of PLS-DA one-class model

2.3 多類別摻假魚油判別分析

為了進(jìn)一步確證摻假陸生動物油脂的種屬源，建立魚油中是否摻假陸生動物油脂的多類別PLS-DA判別模型： 按照豬脂摻假、 雞油摻假、 牛脂摻假和羊脂摻假劃分類別建立判別1模型； 按照非反芻動物油脂摻假和反芻動物油脂摻假劃分類別建立判別2模型。模型結(jié)果如表1、 表2所示。

判別1和判別2結(jié)果均表明，純魚油樣品的不確定性分類樣品比率為0.00%，識別率和拒絕率均為100.00%，這一結(jié)果與單類別判別模型結(jié)果相同。圖3(a)和圖3(f)的判別線將純魚油樣品和摻假陸生動物油脂樣品成功區(qū)分，未出現(xiàn)混雜樣品。

對判別1的結(jié)果進(jìn)行分析，牛脂、 豬脂、 羊脂和雞油摻假樣品的不確定性分類比率依次降低，分別為43.59%，30.00%，20.08%和15.38%(表1)； 整體的識別率和拒絕率在82.10%和92.30%(表1)之間； 其中雞油摻假樣品的拒絕率和識別率最高，誤判率為7.70%(表1)，不確定分類樣品比率最低，判別效果最優(yōu)。圖3(b)中摻假豬脂樣品有多個樣品并未正確分類，且少量雞油摻假樣品和牛脂摻假樣品被判定為豬脂摻假樣品； 圖3(c)中部分豬脂摻假樣品被誤判為雞油摻假樣品； 圖3(d)和圖3(e)為摻假牛脂和摻假羊脂樣品的判別1預(yù)測結(jié)果，牛脂摻假和羊脂摻假樣品相互誤判現(xiàn)象明顯。上述討論表明，豬脂摻假樣品和雞油摻假樣品互為主要的誤判樣品來源，牛脂摻假樣品和羊脂摻假樣品同樣相互混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，此分析與PCA結(jié)果一致。

表1 魚油摻假陸生動物油脂種屬PLS-DA多類別判別1預(yù)測結(jié)果Table 1 Results of first PLS-DA multi-class predictions

表2 魚油摻假陸生動物油脂種屬PLS-DA多類別判別2預(yù)測結(jié)果Table 2 Results of second PLS-DA multi-class predictions

圖3 多類別PLS-DA判別模型結(jié)果(a): 純魚油判別1結(jié)果； (b): 豬脂摻假判別1結(jié)果； (c): 雞油摻假判別1結(jié)果； (d): 牛脂摻假判別1結(jié)果；(e): 羊脂摻假判別1結(jié)果； (f): 純魚油判別2結(jié)果； (g): 非反芻動物油脂摻假判別2結(jié)果； (h): 反芻動物油脂摻假判別2結(jié)果Fig.3 Results of PLS-DA multi-class model(a)： Discrimination 1 for pure fish oil; (b)： Discrimination 1 for lard; (c)： Discrimination 1 for chicken oil; (d)： Discrimination 1 for tallow； (e)： Discrimination 1 for suet； (f)： Discrimination 2 for pure fish oil; (g)： Discrimination 2 for non-ruminant lipid; (h)： Discrimination 2 for ruminant lipid

基于上述分析，重新劃分判別類別，判別2的結(jié)果表明，摻假陸生動物油脂樣品的不確定性分類比率均下降到10%以內(nèi)，其中非反芻動物油脂摻假樣品和反芻動物油脂摻假樣品的不確定性分類比率分別為6.33%和6.41%(表2)； 整體拒絕率和識別率提升至90%以上，反芻動物油脂摻假樣品的判別效果較優(yōu)，識別率和拒絕率分別為97.40%和96.70%(表2)，誤判率為2.90%(表2)。圖3(g)和圖3(h)所示的摻假非反芻和反芻動物油脂魚油的判別2預(yù)測結(jié)果表明，摻假反芻和非反芻動物油脂摻假樣品之間的混雜樣品較少，這一結(jié)果同樣與PCA結(jié)果基本一致。

結(jié)果表明PLS-DA結(jié)合中紅外光譜技術(shù)可以判別純魚油和多類別陸生動物油脂摻假魚油，可應(yīng)用于魚油樣品摻假陸生動物油脂種屬源的確證分析。

3 結(jié) 論

一種快速篩查結(jié)合確證分析的連續(xù)分類策略應(yīng)用于魚油摻假陸生動物油脂的檢測。中紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)可以篩分純魚油和摻假陸生動物油脂魚油，識別率和拒絕率均為100.00%，所建立的多類別判別模型可以進(jìn)一步確證摻假陸生動物種屬源，拒絕率和識別率均達(dá)到82.00%以上，其中雞油摻假樣品和反芻動物油脂摻假樣品判別效果最優(yōu)。該方法作為一種快速篩查與確證分析工具可滿足大樣本量魚油中陸生動物油脂摻假的檢測需求。