基于流式細胞儀和高通量測序技術聯用的超微藻檢測方法

寧 曼，徐 崢，何義亮

(上海交通大學中英國際低碳學院，上海 200240)

超微藻是水體中藻種群結構的重要組成部分，由于其獨特的生長特性和豐富的物種組成，近年來受到國內外學者的廣泛關注，成為水體中微生物構成的研究熱點。超微藻在數量上雖不如傳統的非超微藻[1]，但其對水體初級生產力和群落結構多樣性及穩定性等方面貢獻巨大，深入了解超微藻的動態變化規律有利于更好的評估水體水質質量。

目前的研究中，對超微藻進行檢測的手段很少，且具有局限性。光學顯微鏡受到放大倍數和分辨率的限制[2]，無法滿足細胞計數和種群識別的要求，具有耗時長、人為誤差明顯的缺點。而熒光顯微鏡對自發熒光較弱且混合生長的藻群辨認準確率低，不能反映藻細胞的生理狀況。平板計數法耗時長，操作過程中對無菌環境條件要求極嚴格，且因超微藻大部分種屬不能直接進行分離純培養而無法運用[3]。

針對以上難點，流式細胞儀和高通量測序技術的運用為超微藻總量測定和種群識別提供了新方向。流式細胞儀能對超微藻進行計數和熒光檢測，得到藻細胞數量，根據色素含量及與純培養藻細胞位置的對照完成藻群識別，但一般只能精確到門級別，需要分子生物學手段的輔助從而獲得更加準確的種屬信息。高通量測序技術作為分子生物學技術的一個重要分支[4]，明確不同微生物的注釋信息和相對豐度變化信息，有助于對微生物多樣性及其分布模式進行更深入的探究，但針對超微藍藻和超微真核藻的高通量測序方法還有待進一步研究和優化。在測序微生物的收集方法上，傳統的水樣過濾方法在很大程度上造成了對環境中超微藻多樣性的低估[5-6]，流式細胞儀的分選功能可有效去除水體中大部分不能自發熒光的細菌、真菌等[7]，減少異樣模版的競爭，提高超微藻序列在整個克隆庫中的比例，解決了對超微藻細胞進行有效收集和保存的難題。近年來，已有研究嘗試使用流式細胞儀分選功能進行真核藻類的分選[1]，但研究范圍較局限。

本研究針對超微藻檢測進行方法體系的構建和優化調整，在前人的基礎上將流式細胞技術和高通量測序技術進行聯用，改進技術流程和參數，流式細胞儀對超微藻的分選功能可以彌補高通量測序技術異養細菌干擾的缺點，而高通量測序技術鑒定精確到種級別的優點可以彌補流式細胞儀對超微藻識別不精確的問題。通過細胞大小和熒光分析對藻群變化初步認識，再利用流式細胞儀分選目標藻群，隨后進行高通量測序，更好地揭示超微藻的結構特征和生物多樣性。本研究提出綜合運用流式細胞技術和高通量測序技術進行方法的互補融合和多功能聯動，是非常重要而基礎的方法改進。

1 方法的構建

1.1 整體流程的提出

綜合運用流式細胞技術和高通量測序技術對超微藻進行檢測，方法構建流程如圖1所示。通過流式細胞儀的分析、分選功能和高通量測序技術的聯用，獲得超微藻的數量和種屬信息，對特定采樣周期的樣本進行分析，獲得超微藻構成的動態變化特征。

圖1 方法構建流程Fig.1 Flow Chart for Method Construction

1.2 流式細胞儀參數設置及調整

1.2.1 溶液配制

鞘液的配制：準確稱量NaCl(80 g)、KCl(2 g)、Na2HPO4·12H2O(35.8 g)、KH2PO4(2.4 g)，加入盛有1 L ddH2O的燒杯中，攪拌均勻，待完全溶解后通過0.22 μm微孔濾膜過濾，添加ddH2O至10 L，溶液置于桶中用高壓滅菌鍋進行121 ℃滅菌15 min，待鞘液冷卻至常溫后倒入分選儀器加液桶備用。

熒光微球(FluoSpheresTMcarboxylate，2 μm，yellow-green 505/515)原始濃度為4.65×109particles/mL，嚴格避光貯存于2～4 ℃冰箱中，吸取前使用超聲波清洗機超聲10 min，防止帶磁性的微球吸附在管壁上，斡旋機高速振蕩3 min，使微球混合均勻。配制中間液時，加入蒸餾水進行梯度稀釋，使熒光微球在水樣中的最終濃度與藻細胞濃度相近，本試驗熒光微球最終濃度為4.65×104particles/mL。中間液需現配現用，置于5 mL鎖扣蓋式無菌BD Falcon流式管中。

1.2.2 參數設置及調整方法

采用流式細胞儀(beckman coulter，BD)對樣本中的藻細胞進行分析，儀器配備水冷氬離子激光器，選用的激發波長為488 nm和633 nm。由于藻細胞含有葉綠素和藻膽素等天然色素，可自發熒光無需染色，根據光合色素的光學特征，設置5個熒光通道：前向散射光(FSC，488/10)表征細胞大小；側向散射光(SSC，488/10)表征細胞內部結構的復雜程度；PE，585/42表征藻紅蛋白的含量；APC，780/60表征藻藍蛋白的含量；PC5.5，690/50表征葉綠素a的含量[9]。水樣通過40 μm的濾網過濾，防止阻塞儀器。進行預試驗驗證熒光通道的有效性并對儀器參數進行調整，主要分為以下3個步驟：作為空白對照，1 mL無菌ddH2O置于5 mL無菌流式管中進行上樣，調整各通道閾值，使無熒光黑團消失，去除水中雜質、破碎細胞及無關細菌的干擾；1 mL適當濃度的熒光微球置于5 mL無菌流式管中進行上樣，調節各通道電壓值，使熒光微球聚集且成像清晰，若出現熒光微球分散的情況，重新配制中間液，并保證溶液混合均勻，與步驟一空白對照組進行比較，去除雜質，調節前如圖2(a)所示，調節后如圖2(b)所示；1 mL過濾后的實際水體樣本置于5 mL無菌流式管中，微調電壓值使細胞全部成像于二維散點圖中，調節進樣速度，使每秒細胞數在100～1 000個。正式上機時，1 mL過濾后的實際水體樣本與熒光微球混合上樣，流速設置為中等流速30 mL/min，待進樣穩定后點擊record，每個樣品運行3 min，每組試驗設置3個平行。

圖2 熒光微球調節示意圖 (a)調整前；(b)調整后Fig.2 Adjustment of Fluorescent Beads (a) before Adjustment； (b) after Adjustment

1.3 超微藻的濃度測定及分選方法

在二維散點圖中將熒光通道兩兩組合，含有相似色素或熒光特征的藻細胞聚集在一起，根據藻細胞藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a熒光強度的相對強弱進行藻群的區分，并與純培養細胞的相對位置進行比對。記錄事件數events，藻細胞的濃度計算方法如式(1)。

(1)

在運用流式細胞儀進行超微藻的分選時，水樣預先通過40 μm的濾網過濾，防止阻塞儀器。過濾后每3 mL樣品放于5 mL鎖扣蓋式無菌BD Falcon流式管中用于上機分選操作，采用流式細胞儀(FACSAria IIr，BD)對樣品中的全部超微藻細胞(包括超微真核藻和超微原核藻)進行分選，溶液配制同1.2.1所述，激光波長、熒光通道同1.2.2所述。觀察分選通道中細胞通過狀態及偏移程度，檢驗進樣口和收集口是否處于無菌環境，預試驗以無菌ddH2O為空白對照去除細菌等雜質的干擾，根據熒光微球在FSC軸的位置劃定分選區域，選用1.5倍鏡，調節熒光通道閾值和電壓值使分選區域位于散點圖中央，如圖3所示。正式分選試驗時，保證進樣口和取樣口處于無菌環境，開啟樣本攪拌功能，設置分選模式為Purity-Mode1，分選速度設定為2.0～4.0，每秒細胞數在1 000個左右。收集分選細胞的流式管中加入1 mL無菌PBS緩沖液和細胞溶解液，每個樣品分選約35 000個細胞，在基因組DNA提取及23S rDNA高通量測序操作前置于-80 ℃冰柜。

圖3 超微藻分選區域Fig.3 Sorting Area of Picophytoplankton Cells

1.4 高通量測序方法

目前，應用于超微藻多樣性研究的靶基因序列主要包括16S rDNA、18S rDNA、功能基因rbcL等[5]，沉降系數和引物選取的不同，呈現出特定的測序結果和方向，高通量測序方法及參數的選取對測序結果具有重要影響作用。用于藻類檢測傳統的方法是16S rDNA測序，對藍藻檢測效果良好，但無法對真核藻類的種屬信息和相對豐度進行全面認識。為了獲得超微藍藻和超微真核藻的序列信息，本研究采用23S rDNA高通量測序方法，方法如下所述，并與傳統16S rDNA高通量測序方法進行補充和對比，方法參照文獻[10]。

購買E.Z.N.A Water DNA提取試劑盒(OMEGA，美國)進行基因組DNA的提取，用于目的片段PCR擴增。隨機選取樣品進行PCR預試驗，調整參數并評估擴增效果，最終確定正式試驗程序，所采用的PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型，選用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反應體系，包括4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mM dNTPs、0.8 μL Forward Primer(5 μM)、0.8 μL Reverse Primer(5 μM)、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA。擴增引物選定雙前向引物(A23SrVF1：GGACARAAAGACCCTATG, A23SrVF2：CARAAAGACCCTATGMAGCT)和雙逆向引物(A23SrVR1：AGATCAGCCTGTTATCC, A23SrVR2：TCAGCCTGTTATCCCTAG)[11]。PCR擴增反應程序參數：a.1× (3 min, 95 ℃)；b.循環數×(95 ℃，30 s；退火溫度：55℃，30 s；72 ℃，45 s)；c.72 ℃，10 min，保持10 ℃直到反應結束。一輪擴增引物A23SrV1F_A23SrV1R，退火溫度為55 ℃，循環次數為25；二輪擴增引物A23SrV2F_A23SrV2R，退火溫度為55 ℃，循環次數為30。在進行擴增產物的純化與回收時，設置3組平行試驗，對電泳后的目標條帶進行切膠回收和定量檢測。本試驗所有樣本PCR質檢報告等級達到B等級以上，Illumina MiSeq平臺雙端測序的原始數據和結果上傳至NCBI網站。

1.5 數據分析與統計

流式細胞儀分析的原始數據以FCS格式儲存，藻細胞的計數和熒光分析通過CytoFLEX軟件完成，根據色素熒光、細胞大小和復雜程度，對照典型藻種純培養試驗結果相對位置，進行水體中藻群的分組，圖片以BMP格式輸出。藻細胞濃度的計算以及藻群的統計通過Microsoft Excel 2019完成，圖表繪制使用Origin軟件。

高通量測序的原始下機數據以FASTQ格式保存，對序列長度、模糊堿基、錯誤堿基、低質量堿基進行質量過濾，使用Mothur軟件進行二次質量篩選去除嵌合體，獲得最終的優質序列。運用Uparse7.0軟件對97%相似水平下的OTU進行聚類分析，采用RDP classifier貝葉斯算法進行每個OTU對應的物種分類學分析，與Silva(Release132 http://www.arb-silva.de)基因數據庫進行比對，分別在各個分類水平域、界、門、綱、目、科、屬、種統計各樣本的群落物種組成。OTU豐度數據進行標準化以確保不同樣品間的一致性，去除豐度小于3的OUT，去除注釋到葉綠體、線粒體的OTU，基于最小樣本序列數進行抽平。本研究采用空白對照法和質量直方圖法進行質控分析，所有樣本的檢測程序和效果均達到標準。

2 方法的實證

2.1 實際水體的選擇與水樣的處理

金澤水庫是上海重要的飲用水水源地之一，來自太湖的原水流入太浦河后再進入水庫，完成一系列的菌藻篩選和水質凈化過程，屬于較典型的“湖泊-河流-水庫”復合型水環境系統，主要分為預處理區、生態凈化區和輸水區，營養級別較低，藻群結構穩定，呈現出較高的超微藻多樣性。本研究所用樣本取自上海金澤水庫，在不同采樣點和不同月份采集0.5 m水深處的表層水體各1 L，儲存于不透光且潔凈的塑料桶中，立即運回實驗室并保存于4 ℃冷庫中，本試驗選取一部分具有代表性的樣本進行分析。

水樣采集以后，一部分用于直接分析和分選，另一部分儲存用于后續或二次操作。每10 mL水樣裝入15 mL滅菌離心管中，添加戊二醛(最終濃度為0.1%)作為細胞固定劑[8]，液氮速凍，并保存在-20 ℃冰柜中，最大限度減少水樣中的細胞損失。使用前放置于37 ℃水浴鍋中解凍，并混合均勻。上樣前所有水樣需通過40 μm的濾網進行過濾，重復操作3次，防止對儀器進樣口造成阻塞。

2.2 超微藻細胞分析及濃度測定

利用試驗采得的新鮮水樣進行流式細胞儀分析，完成藻細胞的識別、群體劃分和濃度測量。根據在FSC軸藻類細胞與已知大小為2 μm熒光微球的相對位置，可將藻細胞劃分為超微藻(小于2 μm)和非超微藻(大于2 μm)，如圖4(a)所示。根據藻類熒光特性，將APC、PC5.5、PE、FSC、SSC坐標軸兩兩組合，水樣中藻細胞呈現出明顯的分組特征，藻群之間位置越接近說明熒光組成和細胞特征越相似，如圖4(b)所示。藻群1藻藍蛋白含量很高，且與聚球藻純培養液在相同條件參數下的位置相近，被劃分為超微藍藻；與藻群1相比，藻群2含有更高的藻紅蛋白和相對較低的藻藍蛋白，被劃分為富含藻紅蛋白的超微藍藻；其他藻群屬于真核藻類，含有較高的葉綠素和較低的藻藍蛋白，根據葉綠素含量的不同以及與典型藍藻(Synechococcus)、綠藻(Chlorellavulgaris)、硅藻(Stephanodiscushantzschii)的純培養液的相對位置，藻群3和藻群4區分為超微綠藻和超微硅藻。夏季超微藻生物多樣性高于春季，8月水體樣本中超微藻的數量在103～105cell/mL，其中輸水口數量較多，超微藍藻為2.46×105cell/mL，富含藻紅蛋白的超微藍藻為2.78×103cell/mL，超微綠藻為9.61×103cell/mL，超微硅藻為2.56×104cell/mL。

圖4 藻群劃分 (a)超微藻和非超微藻劃分；(b)特征超微藻群劃分Fig.4 Division of Phytoplankton Groups (a) Division of Picophytoplankton and Nanophytoplankton； (b) Division of Picophytoplankton Groups

2.3 超微藻分選及高通量測序

本試驗每個樣本分選約35 000個超微藻細胞，經預試驗及PCR檢測報告驗證，基因組DNA提取效果良好，高通量測序數據量足夠。得到平均長度為367的1 102 873個有效序列，與Silva數據庫進行比對，共獲得相似水平在97%以上的236 OTUs，超微藻的注釋和分類按照Tranvik等[12]的描述。6個門類的超微藻被檢出，包括藍藻門(Synechococcus，Prochlorococcus)、綠藻門(Nephro-selmis，Tetraselmis，Choricystis，Nannochloris)、不定鞭藻門(Pseudo-nitzschia，Ochromonas，Thalassiosira、Chaetoceros)、異隱藻門(Cryptomonas，Teleaulax)、定鞭藻門(Emiliania，Chrysochromulina)和囊泡藻門(Dinophysis)。根據根據色素分析和豐度變化情況，判定流式細胞儀分析檢測到的藻群2(富含藻紅蛋白的超微藍藻)是聚球藻(Synechococcu)的其中一種，藻群4(超微硅藻)的主要組分是海鏈藻(Thalassiosira)。與傳統的過濾水樣16S rDNA測序方法進行比較，除了普遍受到關注的超微藍藻聚球藻以外，流式細胞儀分選和23S rDNA高通量測序的方法發現了更為豐富的超微藍藻和超微真核藻，更好地揭示了水體中超微藻的生物多樣性。與傳統方法的藻類占比(<10%)相比，此方法藻類OTU占比達到76.3%，異養模版的干擾大大降低，由于分選操作對目標藻群的聚焦，相對豐度很低(<0.01%)的藻屬也能被檢測到。不能自發熒光但依然通過流式細胞儀分選與超微藻共同檢出的部分細菌，如疣微菌、厚壁菌和變形菌，可能緊密附著在超微藻細胞的表面未被去除，推測這些細菌與超微藻之間存在著共生關系[13]。

2.4 存在問題分析

盡管流式細胞儀結合高通量測序的這種方法在超微藻監測的應用中具有極大優點，但仍然存在一些缺點，在今后的研究中應注意以下兩個方面。第一，儀器因攜帶不便無法用于現場原位試驗[14]，且對樣本濃度的要求較高，因此，通常需要對新鮮水樣進行固定，如何選用合適的固定劑成為主要問題。較常用的是戊二醛和多聚甲醛，也可適量添加表面活性劑，盡管使用了固定劑，仍可能造成細胞損失，尤其是結構較脆弱的超微藍藻，后續研究應更多關注固定劑種類和濃度的選擇。第二，多細胞的絲狀藍藻，如偽魚腥藻、浮絲藻等，無法用流式細胞儀進行計數和分選[15]，應采用其他輔助方法來彌補流式細胞儀對絲狀藍藻檢測不足的缺點。

3 結論

(1)通過流式細胞儀和高通量測序技術的聯用，實現了超微藻檢測方法體系的構建。流式細胞儀對超微藻群進行識別、計數和分選，23S rDNA高通量測序得到超微藻種屬信息，從而深入探究超微藻群落結構在時間和空間上的動態變化規律。

(2)通過對取自上海金澤水庫實際水體樣本中超微藻的分析，檢驗了此方法的可行性和有效性。分選操作和高通量測序方法的優化極大減少了異養模版的干擾，獲得更多的超微藻序列，大大提高低相對豐度藻屬的檢出率。

(3)金澤水庫夏季水體中超微藻數量在103～105cell/mL，共檢出6個門類的超微藻，包括藍藻、綠藻門、不定鞭藻、異隱藻、定鞭藻和囊泡藻，超微藻的多樣性較高。