原發(fā)性肝癌常見動物模型的研究進(jìn)展

夏 猛， 孫玉浩， 王 萌， 冷 靜

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃二科室， 南寧 530023

動物模型是研究原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行藥物篩選研究的重要載體，目前的動物模型主要包括小鼠、大鼠、兔、樹鼩等雄性幼齡動物為主，常用的建模方法包括自發(fā)型、誘發(fā)型、移植型和基因修飾型等[1]。本文通過對文獻(xiàn)搜集梳理綜述了以上模型特點(diǎn)，并進(jìn)行總結(jié)歸納，以期提供建議參考。

1 常用于構(gòu)建肝癌模型的動物

1.1 小鼠 小鼠與人類在基因水平上高度同源，是復(fù)制人類疾病和研究基因功能的常選動物。選用小鼠作為PHC模型的優(yōu)點(diǎn)是：(1)實(shí)驗(yàn)成本低；(2)生存率高，飼養(yǎng)方便；(3)可以形成各種實(shí)驗(yàn)用近交系，遺傳性狀穩(wěn)定，利于實(shí)驗(yàn)重復(fù)。常選用誘發(fā)型、移植型、轉(zhuǎn)基因型的造模方法對BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、KM小鼠進(jìn)行造模。裸鼠是由BALB/c近交系小鼠基因突變而來，最主要的特點(diǎn)是沒有胸腺，不排斥異種動物的組織，多用移植型造模方法進(jìn)行造模[2]。

1.2 大鼠 大鼠的基因序列、全基因組與人類相似，抗病力強(qiáng)，對外界環(huán)境的適應(yīng)力強(qiáng)，存活率高，動物器官、組織也較小鼠大，方便后期實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的觀察與統(tǒng)計[3]。體型適中，可以提供足夠的實(shí)驗(yàn)分析所需要的血液、體液樣本，易于實(shí)驗(yàn)操作。另外大鼠肝臟再生能力強(qiáng)，切除60%～70%的肝葉仍有再生能力，適合肝臟相關(guān)疾病的研究[4]。大鼠自發(fā)型腫瘤的發(fā)生率低[5]，多選用誘發(fā)型的造模方法，如二乙基亞硝胺( diethylnitrosamine，DEN)聯(lián)合CCl4對SD大鼠、Wistar大鼠、F344大鼠等進(jìn)行肝癌造模[6]。

1.3 兔 兔是目前少有的大型肝癌動物模型，通過移植接種VX2瘤株，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[7]。新西蘭或日本大白兔是目前常用的兩個兔類品種，主要用于肝外或肝同種移植型的肝癌模型研究。兔的肝癌模型具有：(1)模型成型快，造模方法簡單易操作；(2)造模成功后的腫瘤類型和人類巨塊型肝癌腫瘤類似，可較好的還原人類巨塊型肝癌發(fā)病過程；(3)造模周期短，價格低廉，模型存活率高；(4)兔體型大，可接種的部位廣泛，肝、腎臟等部位都可以接種[8]。然而兔VX2肝癌模型易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，對單純研究PHC存在一定的影響。

1.4 樹鼩 樹鼩在生理、生化和解剖學(xué)等生物學(xué)特性方面與人類有很高的相似性，用樹鼩建立肝癌模型進(jìn)行肝癌病因和發(fā)病方面的研究，有著其他動物不可代替的優(yōu)勢[9-10]。選用樹鼩作為PHC模型的優(yōu)點(diǎn)為：(1)對肝炎病毒有易感性，可以模擬人類感染HBV后發(fā)展至肝癌的發(fā)病過程，為研究HBV與肝癌發(fā)病的關(guān)系提供了一個很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚11]；(2)進(jìn)化水平高，新陳代謝和機(jī)體解剖比鼠類動物更接近與人[12]。但樹鼩產(chǎn)仔少、膽小、易受驚嚇，在一定程度上影響其推廣[13]。目前造模常用的樹鼩品系為：樹鼩瑤山亞種(Tupaiabelangeritonquinia)、樹鼩滇西亞種(Tupaiabelangerichinensis)。

1.5 土撥鼠 土撥鼠是目前在HBV研究中應(yīng)用廣泛的模型動物。選用土撥鼠作為PHC模型的優(yōu)點(diǎn)為：(1)土撥鼠肝炎病毒(WHV)與HBV的核苷酸同源性達(dá)到60%以上；(2)土撥鼠感染W(wǎng)HV后的免疫反應(yīng)類型和強(qiáng)度也與人感染HBV高度相似[14]；(3)壽命可達(dá)10年之久，在制備慢性HBV感染的動物模型中具有獨(dú)特優(yōu)勢。雖然沒有肝硬化和腹水的階段，但對模擬病毒感染、肝癌的后續(xù)發(fā)展以及對病毒和腫瘤的免疫反應(yīng)都有極高的研究價值，多用于抗病毒藥物的篩選、免疫學(xué)研究等[15]。

1.6 斑馬魚 斑馬魚作為PHC模型有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)與人類基因高度同源；(2)肝細(xì)胞的組成、功能等與人類相似；(3)生長發(fā)育迅速，產(chǎn)卵快，易于大規(guī)模飼養(yǎng)；(4)透明性胚胎，易于觀察腫瘤進(jìn)展。目前多采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對斑馬魚進(jìn)行肝癌模型的構(gòu)建[16]，如xmrk/kras或myc基因突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型等，多用于候選基因與藥物靶標(biāo)的篩選工作(表1)。

表1 不同動物的常用造模方法

2 常用動物模型的建模方案

2.1 自發(fā)型肝癌模型 自發(fā)性肝癌模型是指模型動物在人工創(chuàng)造的環(huán)境條件下，沒有經(jīng)過人工處置而自發(fā)性發(fā)作的腫瘤，這種模型最大的優(yōu)點(diǎn)就是排除了人為因素的干擾，較好還原了動物模型在自然條件下的發(fā)病情況[29]。自發(fā)型肝癌模型的發(fā)病時間與動物品系、性別、飼養(yǎng)方式等因素有關(guān)，目前主要用來反映動物的腫瘤易感性、致癌物質(zhì)和環(huán)境因素對肝癌的影響。不過因此類模型的腫瘤發(fā)生率低，即使發(fā)生肝癌，腫瘤(大小、數(shù)目和部位等)和模型動物(性別、體質(zhì)量和腫瘤發(fā)生時間等)都存在很大差異，在臨床病理研究與抗藥研究中數(shù)據(jù)不可控，離散度較大，所以自發(fā)型肝癌模型在現(xiàn)代的動物造模中較少使用。

2.2 誘發(fā)型肝癌動物模型

誘發(fā)型肝癌模型是指使用誘癌因素在實(shí)驗(yàn)條件下誘使動物發(fā)生腫瘤的動物模型。由于這類模型的誘發(fā)因素和條件是人為可控的，誘發(fā)腫瘤的成功率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然發(fā)病率，所以是建模的常用手段之一[30]。誘發(fā)型肝癌模型有建模周期長、成本低、造模成功率高的特點(diǎn)，常用小鼠、大鼠和樹鼩作為造模對象，能夠能準(zhǔn)確反映癌癥生物特性和行為，充分模擬人類腫瘤生長微環(huán)境，是現(xiàn)階段常用的肝癌動物模型[31]。目前常用的誘發(fā)型建模方法主要有以下幾種類型。

2.2.1 DEN誘導(dǎo) DEN是目前常用的誘癌劑，其主要原理是DEN對肝臟有特定的毒性，使肝細(xì)胞大面積壞死，最終誘導(dǎo)PHC的發(fā)生[32]。其致癌有以下特點(diǎn)：(1)操作方便，多采用注射器腹腔注射的形式給藥；(2)誘癌成功率高，小劑量、多次給藥便可誘發(fā)肝癌；(3)對嚙齒類動物誘導(dǎo)肝臟病變具有穩(wěn)定性，可模擬肝損傷-肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生過程[33]。如Chen等[34]用C57BL/6雄性小鼠[6～10周，(22±2)g]，每周0.014% DEN灌胃6 d，第7天正常飲水間隔1 d，持續(xù)15周，第16周檢測小鼠全部造模成功；Seydi等[35]用DEN聯(lián)合2-乙酰氨基芴的方式對雄性SD大鼠進(jìn)行肝癌造模，經(jīng)過15周的造模周期，通過組織病理學(xué)檢查、肝損傷標(biāo)志物及AFP等指標(biāo)證實(shí)造模成功。

2.2.2 CCl4誘導(dǎo) CCl4是一種肝臟的毒性物質(zhì)，其主要原理是通過反復(fù)急性肝損傷、炎癥和修復(fù)導(dǎo)致纖維化，最終誘導(dǎo)產(chǎn)

生肝癌[36]。運(yùn)用CCl4造模有以下特點(diǎn)：(1)腹腔注射的濃度與頻率會影響其作用部位及毒性，高濃度的CCl4首先損傷的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其次再累及肝、腎；而低濃度長期注射則主要損傷肝、腎功能[37]；(2)模型穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好；(3)乙醇可以促進(jìn)CCl4的吸收，加重中毒癥狀，所以目前大多選用CCl4與DEN 和/或乙醇聯(lián)合使用誘導(dǎo)肝癌發(fā)生，來減少造模周期，提高造模穩(wěn)定性[38-39]，如Brol等[40]在小鼠體內(nèi)用CCl4和乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)7周后，肝臟炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，伴有明顯的肝纖維化和中度脂肪變性。另外停止注射CCl4后模型動物具有自愈性，因此在造模過程中不能間斷CCl4刺激[41]。CCl4揮發(fā)性強(qiáng)，在操作過程中要有必要的安全防護(hù)，同時也要注意密封保存，防止揮發(fā)，影響濃度。

2.2.3 其他化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo) AFB是由曲霉屬真菌產(chǎn)生的一種雙呋喃環(huán)類毒素。AFB有強(qiáng)烈的致癌性，不過因其毒性強(qiáng)，劑量不易控制，對不同鼠類的易感性不同等缺點(diǎn)，現(xiàn)代動物造模中常把AFB飲食作為輔助造模方法使用[42]；硫代乙酰胺(TAA)是一種化學(xué)致癌物，TAA進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可引起肝細(xì)胞壞死和肝纖維化，同時易產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素血癥，使肝臟功能進(jìn)一步惡化，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[43]，如Helmy等[44]用TAA誘導(dǎo)雄性SD大鼠16周，構(gòu)建肝癌大鼠模型；苯巴比妥與二甲氨基偶氮苯作為一種肝臟致癌物，聯(lián)合使用也可以誘發(fā)肝癌，如Pathak等[45]用苯巴比妥聯(lián)合二甲氨基偶氮苯對大鼠進(jìn)行長期喂食，在第120天時處死大鼠，檢測肝臟組織，發(fā)現(xiàn)大鼠全部發(fā)生肝癌，造模成功率為100%。

2.3 移植型肝癌動物模型

移植型動物肝癌模型是指把腫瘤組織、細(xì)胞株移植到實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的荷瘤動物模型。這類模型造模成功率高，常在裸鼠、小鼠、大鼠與家兔等動物用皮下移植、腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等方式來構(gòu)建模型。此類造模方法根據(jù)瘤株來源分為同種移植與異種移植。

2.3.1 同種移植模型 最早開始使用的移植型動物肝癌模型是同種移植模型，即同一種屬之間瘤株移植種植。因?qū)嶒?yàn)動物存在近交系、遠(yuǎn)交系之分，即使是同一品系中的不同動物也存在遺傳基因的差異性，因此在構(gòu)建模型時具體分為：(1)自體移植；(2)同種同基因移植(同卵孿生或近交系動物之間的移植)；(3)同種異基因移植(同一物種內(nèi)，遺傳結(jié)構(gòu)不同的個體之間的移植)等3種構(gòu)建方式，免疫排斥反應(yīng)是造模成功與否的關(guān)鍵，其中前兩種移植方法不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，另外裸鼠也可以避免免疫排斥的發(fā)生。如Hepa1-6細(xì)胞株是從小鼠肝癌細(xì)胞中分離得到的，Duan等[46]用Hepa1-6細(xì)胞懸液對BALB/C小鼠進(jìn)行皮下注射的方式進(jìn)行肝癌造模。

2.3.2 異種移植模型 異種移植肝癌模型是將不同種屬來源的腫瘤細(xì)胞株移植到實(shí)驗(yàn)動物上而建立的模型。異種移植肝癌模型也分為以下2種。(1)異位移植: 即把荷瘤生物的腫瘤細(xì)胞或組織移植于模型動物的腋窩、背部皮下等部位，這類方法有成瘤時間快、造模周期短、瘤體觀察方便的優(yōu)點(diǎn)，常用于篩選抗癌新藥的優(yōu)點(diǎn)。不過這種方法沒有體現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，因此異位模型所獲得的治療結(jié)果可能有偏差。(2)原位移植：即把荷瘤生物的腫瘤細(xì)胞或組織移植到動物模型的肝臟上，這類模型的優(yōu)點(diǎn)是可以在體內(nèi)較好的模擬腫瘤生長微環(huán)境，常用于篩選抗癌藥物，易于判斷療效，另外該模型可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，對不同種類、不同部位進(jìn)行特定移植，如Xu等[47]用人肝癌細(xì)胞株HCC LM3在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建原位肝癌移植模型，并在4周后進(jìn)行超聲等影像學(xué)檢查,發(fā)現(xiàn)小鼠原位腫瘤移植成功率為90%(18/20只)。

2.4 轉(zhuǎn)基因(基因修飾)型肝癌動物模型 轉(zhuǎn)基因型動物模型是指把非自身的誘癌或致癌基因通過生信技術(shù)導(dǎo)入或整合到實(shí)驗(yàn)動物模型的基因染色體中并發(fā)揮功能的一類動物模型，近幾年隨著Crispr-Cas9技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，大大提高了精確基因組編輯的準(zhǔn)確率[48]。用Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因型肝癌動物模型，有肝癌發(fā)病率高，動物模型穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，是目前動物模型的研究熱點(diǎn)[49]。

目前常用的主要包括以下幾種：(1)用豬來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，因豬體型大，在解剖、生理、代謝、免疫和遺傳學(xué)等方面與人類相似，是發(fā)展大型動物癌癥模型的理想模式，如Gaba等[50]通過Cre重組酶誘導(dǎo)雜合KRASG12D和TP53R167H轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，形成定點(diǎn)和細(xì)胞特異性腫瘤，即Oncopig癌癥模型，此類模型有與人類肝癌相似的細(xì)胞周期、AFP的產(chǎn)生、化學(xué)敏感性和藥物代謝酶的表達(dá)等特點(diǎn)；(2)用小鼠來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，如Hassan等[51]通過將純合金屬硫蛋白/TGFα和白蛋白/c-myc單轉(zhuǎn)基因小鼠在CD13B6CBA背景下雜交獲得c-myc/TGFα雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并在后代中挑選雄性小鼠，以飲用水中添加鋅加速肝癌發(fā)生的方式來構(gòu)建肝癌動物模型；FRG小鼠是人源化肝臟研究領(lǐng)域最重要的模型，Stone等[52]Crispr-Cas9技術(shù)編輯腺病毒(AAV)結(jié)合HBV載體(AAV-HBV)，構(gòu)建HBV過表達(dá)病毒，通過尾靜脈注射的形式，對FRG小鼠進(jìn)行肝癌造模。(3)用斑馬魚來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，斑馬魚有體積小、繁殖發(fā)育快、肝臟再生能力強(qiáng)、基因序列與人類基因序列高度相似等特點(diǎn)，在肝癌動物模型的構(gòu)建中經(jīng)常選用[53]，如Chen等[54]以Tg[fabp10∶rtTA2s-M2; TRE2∶EGFP-kras(G12V)]轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^多西環(huán)素喂養(yǎng)引發(fā)肝癌的方式來構(gòu)建肝癌動物模型。

3 小結(jié)

綜上，肝癌動物模型各有特點(diǎn)，不同物種，不同建模方法，可以形成不同病理特點(diǎn)和生物特性，應(yīng)依據(jù)實(shí)際需要選用合適模型，從目前的研究文獻(xiàn)看，轉(zhuǎn)基因型動物模型的開發(fā)與應(yīng)用在一定程度上模擬了人體肝癌生物學(xué)特征，有助于從遺傳基因?qū)用娼忉尭伟┲虏C(jī)理，為臨床治療和研究抗癌藥物提供有益方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：夏猛、孫玉浩負(fù)責(zé)論文設(shè)計，撰寫論文；王萌參與搜集數(shù)據(jù)，修改論文；冷靜負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。