脾酪氨酸激酶在肝臟疾病中的作用機制

樂瀅玉， 張榮臻， 吳 聰， 肖偉松， 覃小賓， 曾勝瀾， 毛德文

1 廣西中醫藥大學 研究生學院， 南寧 530222； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病一區， 南寧 530023

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是一種72 kD的胞質非受體酪氨酸激酶，是酪氨酸激酶中zeta-鏈相關蛋白激酶70/Syk家族的成員之一，其由兩個SRC同源2結構域和一個C端酪氨酸激酶結構域組成[1]。Syk參與多種細胞類型的信號傳導，在造血細胞中高度表達，包括肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、血小板、B淋巴細胞和未成熟T淋巴細胞，并在這些細胞的信號傳導中發揮重要作用。Syk的異常調控與不同的變應性疾病、抗體介導的自身免疫性疾病(如類風濕關節炎、哮喘、腎臟疾病、肝纖維化和變應性鼻炎)有關[2]。在免疫細胞中，Syk主要通過其串聯SRC同源2結構域與免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosinebased activation motifs, ITAM)相互作用而發揮作用。在肥大細胞中，Syk通過高親和力的IgE受體FcεRI(high affinity IgE receptor, FcεRI)介導下游信號傳導，而在中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞和血小板中，下游信號傳導通過Igγ和FcγR(Fc gamma receptor, FcγR)受體介導[3]。由于Syk在B淋巴細胞和T淋巴細胞受體下游信號傳導中發揮關鍵作用，因此在早期淋巴細胞發育中也扮演著重要角色[4]。Syk被激活后，調節下游信號傳導，驅動先天免疫系統和適應性免疫系統的炎癥通路。除在造血細胞中高度表達之外，研究[5]表明，Syk也在非造血細胞如成纖維細胞、上皮細胞、乳腺組織、肝細胞、神經元細胞和血管內皮細胞中表現出更廣泛的表達模式。Syk在肝細胞中通過G蛋白偶聯受體激活有絲分裂原活化蛋白激酶。除了與肝細胞有關，Syk還可以在肝巨噬細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)和肝竇內皮細胞中表達[6]。然而，關于Syk信號通路在肝病中的研究仍然有限。因此，本文重點討論了Syk在常見肝臟疾病中的作用機制及其作為治療的潛在靶點所面臨的機遇和挑戰，以期為肝臟疾病的治療提供更好的思路和依據。

1 Syk的傳導機制

Syk的免疫受體信號傳導需要滿足以下兩個條件：Syk激酶活性，兩個SRC同源2結構域。Syk激酶結構域在靜止狀態下保持非活性，但可以通過兩個SRC同源2結構域與雙磷酸化的ITAM相互作用而被激活。即使在沒有磷酸化ITAM結合時，接頭區域內的酪氨酸殘基也可導致激酶活化[7]。Syk的SRC同源2結構域與磷酸化ITAM的結合是Syk激活和下游信號傳導的關鍵步驟[8]。Syk既可以通過ITAM磷酸化，也能通過催化其接頭酪氨酸的自磷酸化，促使Syk活化，因此在初始ITAM介導的Syk激活過程中可能存在正反饋機制。活化的Syk與大量下游信號傳導效應因子結合，并通過影響轉錄因子的激活以及將其組裝到轉錄復合物中來參與促炎基因的表達[9]。

2 Syk在肝臟疾病中的作用

2.1 Syk與肝纖維化 肝纖維化是由慢性肝損傷導致組織瘢痕形成和炎癥的過程，可進一步發展為終末期肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[10]。進行性肝纖維化多由病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等疾病引起，以肝臟中細胞外基質過多沉積為特征。據統計，全球肝纖維化發病率高達1%～2%，每年因肝纖維化死亡人數超過100萬[11-12]。HSC在細胞外基質沉積和肝臟纖維形成中發揮核心作用[13]。HSC通常是靜息細胞，并作為類維生素A貯存細胞位于肝細胞和竇狀內皮細胞之間的空隙(Disse空隙)[14]。肝損傷或微環境刺激激活靜息的HSC，導致細胞外基質的產生和積累，引發肝纖維化[15]。此外，活化的HSC失去其類維生素A貯存功能，高度增殖并產生大量趨化因子和細胞因子，進一步增加了細胞外基質的產生[16]。

研究[6]表明，Syk在HSC激活中起關鍵作用，Syk抑制劑在動物纖維化模型(包括四氯化碳誘導的小鼠、二乙基亞硝胺誘導的大鼠和膽管結扎誘導的大鼠模型)中均能有效的阻斷HSC活化，從而有效減弱動物模型中的肝纖維化和HCC的形成。同時，抑制Syk表達可顯著降低纖維化相關基因(包括ACTA2、PDGFRβ、COL1A1)的mRNA和蛋白質表達。此外，Syk存在兩個主要同工型Syk(L)和Syk(S)，其均在肝纖維化和HCC的發展中起著不同的作用。Syk(L)和Syk(S)mRNA在大鼠肝纖維化進程中表達均得到增強，其中Syk(L)的表達水平在肝纖維化中起主要作用，而Syk (S)與腫瘤發生、HCC侵襲和轉移更為相關。據報道[17]，特定轉錄因子的選擇性表達對HSC的激活至關重要。Qu等[6]研究表明，Syk通過調節特定轉錄因子(MYB原癌基因轉錄因子、CREB結合蛋白和MYC原癌基因轉錄因子)的表達以及與HSC增殖相關基因(MYC和CCND1)的表達來進一步促進HSC活化。

2.2 Syk與病毒性肝炎 近期研究[6,18]發現，Syk在HBV和HCV感染的慢性肝損傷患者的肝組織中高度表達，從而誘導HSC的激活和肝纖維化的發生。此外，一項關于HCV相關型HCC患者的基因表達譜的研究[19]表明，Syk是180個上調基因中上調幅度最大的基因之一。

HCV感染還與冰球蛋白血癥(B淋巴細胞增生性疾病)有關。CD81(cluster of differentiation 81，也被稱為TAPA1)是控制B淋巴細胞增殖的抗體的靶點。CD81是HCV侵入的關鍵受體，與HCV包膜蛋白E2相結合會誘導Syk的激活，從而導致ezrin和radixin磷酸化[20-21]。因此，Ezrin、radixin蛋白和Syk是肝細胞中HCV感染的重要調控因子和治療靶點[20]。此外，在HCV感染患者的肝細胞質膜附近觀察到Syk的表達[22]。研究[23]表明，HCV非結構蛋白5A的N末端部分(aa 1-175)以及中央部分(氨基酸237-302)參與了與Syk的物理相互作用，抑制Syk的酶活性；此外非結構蛋白5A抑制了Syk介導的磷脂酶C-γ1的磷酸化，因此，促進HCV感染肝細胞的惡性轉化，并參與肝細胞的癌變。上述研究顯示，在HCV-CD81相互作用前阻斷Syk激活以及調節HCV在靶細胞內的進入和轉運為拓展抗HCV療法提供了新的思路與策略。

2.3 Syk與酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD) ALD是指長期過量飲酒導致的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和HCC。目前我國尚缺乏對ALD的流行病學調查，但據世界衛生組織2018年的報告[24]，全世界每年約有300萬人死于酒精濫用，其中ALD占死亡人數的絕大部分。ALD的發病機制復雜，影響因素繁多，包括乙醇介導的肝損傷、氧化應激、肝細胞損傷引發炎癥反應、腸道通透性和微生物群組的改變[25]。酒精及其代謝產物產生活性氧，通過線粒體損傷和內質網應激誘導肝細胞損傷[26-27]。受損的肝細胞釋放促炎細胞因子和趨化因子，導致免疫細胞的募集和激活。參與ALD進展的核心細胞類型是巨噬細胞，巨噬細胞通過刺激免疫細胞的浸潤和Kupffer細胞(常駐肝巨噬細胞)的激活，在誘導肝臟炎癥中發揮重要作用[25,28]。在ALD患者中，肝臟中的常駐和募集巨噬細胞被細菌內毒素(lipopolysaccharide, LPS)調控的Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)信號通路激活，由于過量飲酒后腸道通透性增加，導致門靜脈和體循環中的LPS升高[29-30]。Syk在TLR4信號傳導中也發揮著重要作用，中性粒細胞、單核細胞中的Syk磷酸化與TNFα、單核細胞趨化因子1等促炎細胞因子的分泌有關[31]。Zhou等[31]研究顯示，受損肝細胞釋放的內源性微粒配體剪接體相關蛋白130是一種危險信號因子，其與LPS協同驅動肝臟炎癥反應。

已有研究[32]證明，酒精性肝炎患者肝臟中Syk表達和磷酸化水平增加。Syk通過腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAF)家族成員相關的NF-κB激活劑結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)或干擾素調節因子3(interferon regulating factor 3, IRF3)信號來調節肝細胞死亡。Syk抑制劑可顯著降低肝臟磷酸化TBK1和磷酸化IRF3水平，減少促炎細胞因子的分泌，從而改善酒精引起的肝損傷和細胞死亡[33]。同時，Syk在脂質積累中也扮演著重要角色，使用Syk抑制劑治療可通過抑制脂質生物生成和促進脂質代謝來預防及改善酒精誘導的肝脂肪變性[34]。ALD患者肝臟中循環血單核細胞和外周血單核細胞的總Syk以及活化的Syk(pSykY525/526)表達顯著增加。由于Syk與ALD的發病機制密切相關，并且Syk可作為酒精性肝損傷的主要信號分子，因此，Syk抑制可以預防和減弱酒精性肝臟炎癥、細胞死亡、脂肪變性等ALD的各個階段。

2.4 Syk與非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指包括單純性脂肪肝、NASH、肝纖維化和HCC的一系列不同程度的肝損傷[35]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，NAFLD的發病率呈逐年上升的趨勢，全球發病率約為25.2%，亞洲發病率高達27%，發病率隨地區和社會條件的差異而略有變化(22.1%～28.6%)[36]。NASH是NAFLD更為嚴重和具有臨床意義的階段，臨床表現為肝細胞損傷、脂肪變性和炎癥，極易發展為終末期肝病和HCC[37]。

NASH的進展與TLR和核苷酸寡聚化結構域樣受體(nucleotide oligomeric domain-like receptors, NLR)等危險信號的逐漸積累有關[38]。LPS與TLR4的相互作用在具有炎癥響應的先天免疫與和Kupffer細胞激活之間起著重要作用[39]。在NASH發展過程中，活化的Kupffer細胞產生的炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和趨化因子CCL2、FcγR1有助于循環血單核細胞與巨噬細胞進入炎癥性肝臟。同時，活化的Kupffer細胞還分泌TNFα和TNF相關的凋亡誘導配體，誘導鄰近肝細胞參與炎癥反應和細胞凋亡，誘發和促進NASH發生發展[40]。

TRAF-6是多種信號通路中的共享分子，并通過適配器MyD88和IRAK-1(IL1受體相關激酶1)與TLR4相互作用。Syk通過與TRAF-6的關聯，在IL-1誘導的趨化因子釋放中發揮作用。TLR4通過B淋巴細胞受體傳導信號誘導Syk活化，并對B淋巴細胞存活、增殖和B淋巴細胞受體介導的免疫應答至關重要[41]。T淋巴細胞和B淋巴細胞參與NASH的進展，暗示了Syk在這一過程中的作用。

研究[32]表明，相比于正常肝臟，NASH患者肝臟中Syk表達與NAS評分(NAFLD活性評分)升高呈正相關。Syk通過模式識別受體途徑和NLR途徑參與NASH的發病，而部分NLR在炎性小體的形成中起關鍵作用。核苷酸結合寡聚化結構域富含膿素亮氨酸重復序列結構域3炎癥小體激活需要Syk參與，并形成炎癥小體復合物[42]。因此，核苷酸結合寡聚化結構域富含膿素亮氨酸重復序列結構域3炎癥小體的體內藥理抑制作用可以減輕NASH的肝臟炎癥、肝細胞損傷和肝纖維化程度[32,43]。

2.5 Syk與HCC 肝細胞凋亡和代償性增殖是HCC發生發展的關鍵驅動因素，而Syk在HCC的發生發展中扮演重要角色。研究[44]表明，腸道菌群、LPS以及TLR4的信號傳導與慢性損傷性肝臟炎癥和癌變有關，腸道菌群的LPS通過激活TLR4可以促進損傷和炎癥驅動的腫瘤生長，LPS-TLR4途徑可通過增加非骨髓源性常駐肝細胞中的增殖和抗凋亡信號來促進HCC，而Syk通過參與調節LPS-TLR4途徑之間的相互作用來影響HCC的發生發展。Yuan等[45]研究發現，HCC腫瘤組織中存在27%Syk基因被甲基化，Syk基因甲基化與Syk mRNA或蛋白表達的缺失高度相關，并在基因沉默中起因果作用。Syk甲基化和表達的缺失有助于肝癌的發展，并且是HCC患者總生存率的預測指標。此外，在HCC細胞中發現Syk啟動子的甲基化是負向調控的。在Syk沉默的HCC細胞系中恢復Syk表達可降低肝細胞的生長、細胞遷移和侵襲，但有助于細胞與基質的黏附[46-47]。

Checkpoint激酶1(Checkpoint kinase 1, CHK1)是一種進化保守的Ser/Thr激酶，在DNA損害后變得活躍。研究[48]表明，CHK1的高表達具有致癌作用，并與HCC患者的不良預后有關。CHK1能夠使腫瘤抑制因子Syk(L)在Ser295位點發生磷酸化，并誘導其蛋白酶體降解，從而促進HCC的發生發展。但是，Syk(L)的非磷酸化突變體可抑制HCC細胞系的增殖、集落形成和腫瘤生長。因此，在HCC患者中CHK1和Syk(L)的表達水平呈明顯的負相關。有趣的是，另一研究[49]發現，Syk(L)和Syk(S)在對抗HCC侵襲和轉移方面具有相反的調節作用。Syk(S)會促進腫瘤生長和轉移，抑制細胞凋亡，并對抗Syk(L)的相反作用。而Syk(L)可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。同時，Syk(L)表達水平上調或Syk(S)表達水平下調對HCC患者3年和5年的復發時間以及總體生存曲線明顯延長，使肝癌切除術后患者的腫瘤早期復發率明顯下降。因此，Syk(L)和Syk(S)的表達水平是HCC患者預后的有力預測指標。

3 Syk抑制劑

近年來，Syk信號通路已被認為是各種疾病新興的治療靶標，尤其是在肝臟疾病。Syk抑制劑的研究亦得到社會廣泛的關注，并且有部分藥物已進入動物實驗及臨床研究，療效可觀。研究[32-33]表明，R406可阻斷Fc受體信號通路及NF-κB信號通路、抑制炎性小體激活、減少巨噬細胞和其他肝細胞中Syk的表達和磷酸化，最終達到抑制脂肪變性、炎癥和纖維化，改善非酒精性和酒精性脂肪性肝炎。GS-9973是一種新型的口服Syk抑制劑，通過抑制Syk的Y525/526磷酸化，降低HSC活化因子(MYB原癌基因轉錄因子、CREB結合蛋白和MYC原癌基因轉錄因子)和HSC增殖因子(MYC、CCND1)的表達水平，抑制造血干細胞增殖和活化，最終起到抗肝纖維化和抗癌作用[6]。PRT062607和Piceatannol兩種抑制劑可導致腫瘤內p16和p53表達水平升高而使抗凋亡蛋白Bcl-xL及SMAD4表達水平降低。此外，還能影響肝臟中有關細胞凋亡和細胞衰老的基因表達，抑制雷帕霉素靶蛋白、IL-8信號轉導和氧化磷酸化。最終選擇性地阻斷Syk磷酸化、顯著減少炎癥細胞浸潤和HSC分化，抑制肝纖維化及肝癌的發展進程[50]。盡管Syk抑制劑現已在動物實驗和臨床研究中取得不錯的療效，但仍然存在著一些問題尚未解決;(1)長期安全性尚未得到證實;(2)Syk在不同細胞中普遍表達，Syk抑制劑對多種細胞功能的全面抑制可能會產生副作用；(3)目前，關于Syk抑制劑的研究多停留在動物實驗研究，要轉化為臨床療效，仍尚需進一步大量的研究。因此，如何在不破壞細胞生理功能的情況下抑制病理過程是Syk抑制劑廣泛應用于臨床的主要挑戰之一。

4 小結

綜上所述，Syk作為一種新型的潛在治療靶點，其與慢性肝臟疾病的發生發展密切相關。明確Syk在慢性肝臟疾病中具體的作用機制，有利于新型藥物的開發，并為肝臟疾病的治療提供新策略和新思路。雖然近年來有關Syk對肝臟疾病作用的研究較多，一些小分子Syk抑制劑在試驗研究中取得不錯的成績，但仍存在長期安全性以及臨床療效的不確定性等許多尚未闡明的關鍵問題，故尚需對該領域進一步深入探索，為肝臟疾病的臨床防治提供新的策略和實驗支撐。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：毛德文、樂瀅玉負責研究選題；張榮臻、吳聰、肖偉松負責設計論文框架，起草論文；毛德文、樂瀅玉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿；覃小賓、曾勝瀾負責修訂論文。