小干擾RNA沉默甲胎蛋白基因對HepG2細胞遷移及侵襲的影響

韓 偉， 魏豐賢， 張有成

蘭州大學第二醫院 普通外科， 蘭州 730030

原發性肝癌是全球尤其我國癌癥死亡的主要原因之一，總生存率僅為12.1%[1-2]。手術治療目前仍是肝癌治療的首選方案，但臨床中往往面臨早期確診率低，大部分就診患者存在肝內乃至遠處轉移情況，導致長期生存率較低[3]。總體而言，肝癌侵襲性強相關的早期轉移和復發是導致患者生存率差的最主要原因，因此侵襲、轉移相關通路一直是肝癌臨床轉化研究的重點領域。

甲胎蛋白(AFP)目前仍是臨床工作中肝癌診斷、預后和隨訪監測的重要標記[4-5]。AFP在肝癌中表現出多種生物活性，前期研究發現用合成AFP小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)轉染肝癌細胞，靶向沉默AFP基因的表達可以抑制肝癌Huh7細胞的增殖，并可誘導腫瘤細胞的早期凋亡[6]，但是目前關于AFP與肝癌侵襲、轉移的關系及機制尚不完全清楚，因此本實驗通過沉默AFP基因在肝癌HepG2細胞中的表達，觀察其對HepG2細胞侵襲、轉移等生物學行為的作用，以及探討其相關機制，為肝癌相關侵襲和轉移的臨床應用轉化提供一定支持。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細胞(中科院上海細胞生物研究所)，PMI1640培養基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，AFP siRNA轉染試劑盒(Invitrogen公司)，Trizol，cDNA反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，紅色熒光標記的寡核苷酸(Invitrogen公司)，AFP ELISA檢測試劑盒(上海西塘公司)，Transwell小室(Millipore公司)，Matrigel(BD Biosciences公司)，AFP一抗(北京博奧森公司)，vimentin (Sigma-Aldrich公司)，AKT，p-AKT，N-cadherin，E-cadherin(美國CST公司)，GAPDH一抗(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 HepG2細胞接種于6孔板，無血清RPMI1640培養基恒溫箱繼續培養24 h，分為空白對照組(不做任何處理)、陰性對照組(轉染陰性siRNA)和AFP siRNA組(轉染AFP siRNA)。

1.2.2 siRNA轉染 AFP siRNA正義鏈序列：5′-AAUUGCAGUCAAUGCAUCUUUCACC-3′，反義鏈序列5′-GGUGAAAGAUGCAUUGACUGCAAUU-3′，按照確定的最佳轉染條件，在6孔板中加入無血清培養基500 μl、AFP siRNA/陰性對照siRNA 10 nM/L以及脂質體轉染試劑5 μl混勻后室溫靜置15 min。取已計數并稀釋的HepG2細胞2.5 ml(細胞計數為1×105/ml)分別加入6孔板中，晃動培養板5 min并輕輕混勻后，恒溫(37 ℃，5% CO2)溫箱中孵育24 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。之后棄用混合液后加入含血清的1640培養基(1 ml)后繼續培養48 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測AFP基因的相對表達量 提取各組細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書操作得到cDNA。qRT-PCR檢測各組細胞中AFP的表達，引物序列為正義鏈5′-GGAAGTCTGCTTTGCTGAAGA-3′和反義鏈5′-CACACCGAATGAAAGACTCGT-3′, β-actin正義鏈5′-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3′和反義鏈5′-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3′。擴增條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s循環40次，72 ℃ 30 s退火，實驗重復3次，2-ΔΔCt法對AFP mRNA的表達進行相對定量分析。

1.2.4 ELISA法檢測細胞上清液中AFP的表達量 各組干預細胞轉染48 h后，收集細胞上清液后進行ELISA實驗。將酶聯免疫儀設置采集450波長處各孔的吸光度值，按ELISA試劑盒說明書，根據所得的標準曲線，計算各組中AFP的含量，并重復3次。

1.2.5 遷移實驗 Transwell上室加入干預后細胞100 μl(細胞數為2×104，培養基不含血清)，下室加入完全細胞培養基750 μl，置于37 ℃恒溫培養24 h，取出上室，固定后染色、漂洗并風干，顯微鏡下觀察并計數遷移細胞的數量(200倍鏡下，隨機5個視野，取其平均值，均重復3次)。

1.2.6 侵襲實驗 將經過干預的細胞100 μl(細胞數為2×104)加入Transwell上室(用稀釋的Matrigel膠包被)，每孔下室加入完全細胞培養基750 μl，余實驗同上，并都重復3次。

1.2.7 Western blotting法測侵襲、轉移相關蛋白表達量

按蛋白提取試劑盒說明書提取HepG2細胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、AKT和p-AKT蛋白。行SDS-PAGE分離蛋白，濕轉法印跡到PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉1 h。分別加入vimentin、N-cadherin、E-cadherin、AKT及p-AKT等一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3遍。然后加入二抗后室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍達30 min。ECL試劑盒顯影后凝膠成像儀顯像，所得條帶灰度掃描后行相對定量分析。

2 實驗結果

2.1 轉染效率 在siRNA為15 nmol/L、脂質體轉染試劑為5 μl/3 ml和細胞數為1×105/ml的體系下，24 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率可達80%以上(圖1)。

注：a,普通光鏡視野下所見；b,熒光顯微鏡同一視野下所見。

2.2 AFP siRNA沉默效率檢測 通過qRT-PCR及ELISA檢測AFP mRNA和蛋白表達變化。與空白對照組相比，AFP siRNA組中AFP mRNA的相對表達量明顯降低(P<0.01)，抑制率達86.440%(表1)；與空白對照組相比，AFP siRNA組細胞上清液中AFP蛋白表達水平降低了85.590%，為(33.930±11.690) ng/ml，差異有統計學意義(P<0.01)(表1)。上述結果表明，AFP siRNA能夠顯著抑制HCC HepG2細胞中AFP的表達。

2.3 沉默AFP基因能夠抑制HepG2細胞的遷移和侵襲能力 遷移實驗結果顯示，與空白對照組相比，AFP siRNA組在Transwell小室的穿膜細胞數下降(P<0.01)(表1)。侵襲實驗結果顯示，與空白對照組相比，AFP siRNA干預組細胞在Transwell小室實驗中的穿膜細胞數下降(P<0.01)(表1)。結果表明，沉默AFP后，細胞的遷移、侵襲能力均被明顯抑制(圖2)。

表1 沉默AFP在mRNA、蛋白水平表達以及肝癌HepG2細胞穿膜細胞率的變化

圖2 沉默AFP對肝癌HepG2細胞縱向遷移和侵襲能力的影響

2.4 沉默AFP基因對HepG2細胞上皮-間質轉化(EMT)相關蛋白的影響 Western blotting實驗發現，各組肝癌HepG2細胞在處理48 h后，與空白對照組相比，AFP siRNA組Vimentin和N-cadherin的蛋白的表達明顯降低(P值均<0.05)，而E-cadherin的表達水平升高(P<0.01)(圖3，表2)。

圖3 Western blotting法檢測各組細胞中AFP及EMT相關

2.5 沉默AFP基因對肝癌HepG2細胞PI3K/AKT信號通路的影響 HepG2細胞在AFP siRNA組轉染48 h后，與空白對照組相比，AFP siRNA組細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白p-AKT的表達被明顯抑制(P<0.01)(表2，圖4)。

圖4 AKT和p-AKT在蛋白水平的表達

表2 各組細胞AFP、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、p-AKT蛋白相對表達量統計分析

3 討論

AFP作為一種診斷HCC的重要的血清學標志物[7]，研究[8-9]表明其與肝癌的復發和轉移密切相關。AFP被報道同時參與了細胞內重要的病理生理過程，例如腫瘤發生、分化及生長等[10]。此外，AFP可以通過PI3K/AKT、p53/Bax/cytochrome c/caspase-3和JAK2/STAT3等轉導途徑抑制細胞增殖并誘導肝癌細胞凋亡[6，11-13],說明AFP也參與到細胞分化和腫瘤發生等過程[14]。因此，AFP不但是一種肝癌伴隨的腫瘤相關抗原，而且在其發生、發展和轉移中也起著重要的作用。然而，AFP在腫瘤侵襲、轉移中的確切作用和機制尚不清楚。在本研究中，初步通過在HepG2細胞株中使用 siRNA進行轉染來沉默AFP基因，能使AFP的表達顯著降低，繼而觀察到細胞的遷移及侵襲性顯著下降。此外，抑制AFP的表達后表現出EMT相關蛋白的表達變化。

腫瘤細胞的轉移是一種涉及多個基因的復雜過程，向外周侵襲是促成轉移的關鍵步驟[14]。EMT在促成腫瘤細胞侵襲和轉移的過程中發揮了重要作用，包括細胞黏附素的喪失，細胞骨架成分的喪失、基因表達和細胞外基質的改變[15-16]，其中N-cadherin和Vimentin被認為是最為關鍵的分子之一，已被發現可誘導HCC發生轉移[17]。E-cadherin的表達降低、Vimentin和N-cadherin的表達升高是EMT加速腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟[18]。本研究中，用AFP siRNA轉染人肝細胞細胞系HepG2可導致E-cadherin的上調和Vimentin、N-cadherin蛋白的降低，從而抑制EMT的過程。

在腫瘤的發生和轉移相關的信號通路中，PI3K/Akt信號通路被認為是細胞內重要的信號轉導相關通路[19-20]，在肝癌中可觀察到該通路的異常活化[21]。研究[22]表明，抑制PI3K/Akt信號通路會降低N-cadherin、Vimentin的表達，增加EMT中上皮標志物E-cadherin的表達，并與腫瘤侵襲轉移過程的EMT相互影響。然而，AFP是如何通過肝癌中的PI3K/Akt信號通路調控腫瘤侵襲的機制尚未見報道。通過沉默AFP的表達，本研究發現p-Akt的表達受到抑制，從而導致PI3K/Akt信號通路的中斷，這表明沉默AFP可能通過阻斷PI3K/Akt通路抑制EMT的過程，進而抑制肝癌的侵襲過程。目前常用的肝癌細胞株較多，本研究僅在最為常用的人HepG2細胞中進行了實驗，限于不同細胞株的特性，其他肝癌細胞內的變化情況尚需進一步研究論證。

綜上所述，AFP在肝癌的侵襲和轉移中起著關鍵性的作用。沉默AFP可能通過阻斷PI3K/Akt通路抑制HepG2細胞EMT的過程,進而抑制腫瘤細胞遷移和轉移的能力。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：韓偉負責課題設計，基礎實驗，資料分析，撰寫論文；魏豐賢參與基礎實驗，修改論文；張有成負責擬定課題設計和寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。