NCEH1基因在肝癌組織與細胞系中的表達及生物學作用

曾裕文， 張芳雍， 譚國鉗,2， 吳 帆,2

1 暨南大學附屬廣州紅十字會醫院 肝膽外科， 廣州 510220； 2 廣州市紅十字會醫院 肝膽外科， 廣州 510220

原發性肝癌的發病率持續增長，已居惡性腫瘤死亡率的第四位[1]，盡管目前肝癌治療水平已有較大提高[2]，但其預后依然不容樂觀[3]。探索肝癌侵襲轉移的分子機制及尋找有效的肝癌治療靶點仍是肝癌研究的重要內容。已有研究[4-5]表明，中性膽固醇酯水解酶1(neutral cholesterol ester hydrolase 1，NCEH1)在侵襲性前列腺癌細胞中高表達，抑制NCEH1的表達則可降低前列腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲能力，提示NCEH1是一促癌基因。然而截至目前，NCEH1在肝癌中的表達及作用均尚不清楚。本研究旨在了解NCEH1在肝癌組織及細胞系中的表達情況并探討其對肝癌細胞增殖、凋亡、轉移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 NCEH1基因樣本 選取2013年1月—2019年6月在暨南大學附屬廣州紅十字會醫院手術治療的32例肝癌患者標本及對應的癌旁組織。所有標本離體后立即存放在液氮罐中，然后于-80 ℃深低溫箱中保存。采用實時熒光定量PCR檢測NCEH1基因的相對表達量。同時從ICGC數據庫(https://daco.icgc.org)下載截至2020年9月日本人群的肝癌基因表達數據(包含240個肝癌樣本和220個正常肝組織樣本)作為驗證組，應用R軟件(4.0.2版本)中的limma、beeswarm包對NCEH1基因表達數據進行Wilcoxon秩和檢驗并做散點差異圖進行可視化[6]。

1.2 細胞培養 HL7702正常人肝臟細胞系和SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B人肝癌細胞系均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，293T細胞購自上海吉凱基因化學技術有限公司，細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中，以含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養基培養，按常規進行傳代。

1.3 實時熒光定量PCR 提取細胞總RNA并逆轉錄，在熒光定量PCR儀(TP800，日本TAKARA公司)上行PCR檢測，反應條件為：95 ℃預變性15 s，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進行45個循環，每次在延伸階段讀取吸光值。NCEH1引物為：上游5′- CCTGCCGTCCTTCCTTCTTC-3′；下游5′-CCGTGGTGCCCTGTATCATTA -3′。以管家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內參基因，引物序列為：上游5′- TGACTTCAACAGCGACACCCA -3′；下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA -3′。以2-ΔΔCT法分析各細胞系中NCEH1基因的相對于內參基因的表達水平。若肝癌組織中的NCEH1基因表達水平高于相應的癌旁組織，則為NCEH1表達上調。

1.4 慢病毒介導的小干擾RNA(siRNA) 慢病毒質粒GV122、包裝質粒pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper2.0均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。設計針對NCEH1基因的shRNA序列如下，正義鏈：5′-CCGGATCCAGGCAGAATTTGCATTTCTCGAGAAATGCAAATTCTGCCTGGATTTTTTG-3′，反義鏈：5′AATTCAAAAAATCCAGGCAGAATTT-GCATTTCTCGAGAAATGCAAATTCTG- CCTGGAT-3′；陰性對照組序列為，正義鏈：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAA- GAGAA-CGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′,反義鏈：5′-AATTCAAAAATTCTCCGA- ACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。上述序列由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，將其所形成的雙鏈DNA分別連接到siRNA慢病毒質粒GV122，再將上述質粒分別與pGC-LV、pHelper1.0和pHelper2.0 3個包裝質粒共轉染至 293T 細胞，上述兩種慢病毒各自感染的SMMC-7721肝癌細胞系即被分別命名為NCEH1敲減組(KD組)和陰性對照組(NC組)。采用熒光倒置顯微鏡(micropublisher 3.3RTV，日本奧林帕斯公司)觀察兩組細胞的慢病毒感染效率，并采用實時熒光定量PCR法檢測兩組細胞中NCEH1基因的相對表達水平，以檢測NCEH1基因的敲減率。

1.5 MTT實驗檢測肝癌細胞生長增殖能力 將KD組及NC組SMMC-7721細胞培養于6孔板中，完全培養基重懸成細胞懸液，選取5塊96孔板，分別標記為1、2、3、4、5 d；每組設置3個復孔，每孔加入100 μl細胞懸液，每板分別鋪3組細胞。從鋪板后第2天開始，培養終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中。4 h后完全吸去培養液，加100 μl DMSO溶解甲瓚顆粒。振蕩器振蕩2～5 min，酶標儀490/570 nm檢測光密度(OD)值。

1.6 Annexin V-APC單染法檢測肝癌細胞凋亡率 將KD組及NC組SMMC-7721細胞培養于6孔板中，完全培養基重懸成細胞懸液，與上清細胞收集于同一5 ml離心管中。然后1300 r/min離心5 min，棄上清，4 ℃預冷的PBS洗滌細胞沉淀。1×binding buffer洗滌細胞沉淀一次，1300 r/min離心3 min，收集細胞，200 μl 1×binding buffer重懸細胞沉淀，加入10 μl Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min。根據細胞量，補加400～800 μl 1×binding buffer，上機檢測。

1.7 劃痕愈合實驗檢測肝癌細胞遷移能力 將KD組及NC組SMMC-7721細胞培養于6孔板中，完全培養基重懸成細胞懸液，根據細胞大小決定鋪板細胞密度。置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。第2天使用劃痕儀對準96孔板的上端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用PBS輕輕漂洗2～3遍，加入含1% FBS血清培養基，0 h掃板。再次于37 ℃、5% CO2培養箱培養，根據愈合程度選擇合適時間用Celigo掃板，用Celigo分析遷移面積并計算遷移率。

1.8 Transwell轉移和侵襲實驗 將Transwell小室置于新的24孔板中，上室加100 μl無FBS培養基，37 ℃培養箱中放置1 h。將KD組及NC組SMMC-7721細胞加入每個小室，下室內加入含30% FBS的培養基600 μl，5% CO2、37 ℃孵育48 h。倒扣小室于吸水紙上以去除培養基，用棉拭子輕輕移去小室內非轉移細胞，將小室置于4%多聚甲醛固定液中固定30 min后撈出，用吸水紙吸干小室表面固定液，滴1～2滴染色液到膜的下表面染色轉移細胞1～3 min后，將小室浸泡沖洗數次，空氣晾干。在顯微鏡下拍照并計算各組轉移細胞數。如將Transwell小室先鋪Matrigel膠再重復上述實驗步驟即為Transwell侵襲實驗。

1.9 倫理學審查 本研究通過暨南大學附屬廣州紅十字會醫院倫理委員會審核，批號：穗紅院醫倫審2019-028-01。所有標本采集前均已獲患者知情同意。

2 結果

2.1 肝癌組織中NCEH1的表達 實時熒光定量PCR檢測結果顯示，在32例患者標本中，有22例肝癌組織中的NCEH1基因表達上調，NCEH1基因在肝癌組織中的平均表達量高于相應的癌旁組織(Z=2.263，P=0.024)(圖1a)。下載ICGC數據庫中日本人群的肝癌標本(包含240個肝癌樣本，202個正常肝組織樣本)，篩選出每個樣本中NCEH1基因表達量進行分析。結果顯示，NCEH1基因在肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織(U=18 768，P<0.001)(圖1b)。

注：a，NCEH1基因在32例肝癌及癌旁組織中的相對表達量；b，ICGC數據庫中NCEH1基因在肝癌中的表達量。

2.2 NCEH1在肝癌細胞系中的相對表達水平t檢驗結果顯示，NCEH1在中等侵襲轉移潛能的SMMC-7721和Bel-7402細胞系中的相對表達量較低或無侵襲轉移潛能的HepG2(0.004 2±0.000 2 vs 0.002 9±0.000 4，t=4.651，P=0.01；0.003 9±0.000 3 vs 0.002 9±0.000 4,t=3.218,P=0.03)和Hep3B細胞系高(0.004 2±0.000 2 vs 0.002 7±0.000 2,t=9.496,P=0.001；0.003 9±0.000 3 vs 0.002 7±0.000 2，t=3.218,P=0.005)；而NCEH1在低或無侵襲轉移潛能的HepG2和Hep3B細胞系中的相對表達量較正常HL-7702肝細胞系高(0.002 9±0.000 4 vs 0.001 5±0.000 1,t=5.682,P=0.005; 0.002 7±0.000 2 vs 0.001 5±0.000 1,t=11.302,P=0.000 3)。

2.3 慢病毒的感染效率及NCEH1基因敲減效率 熒光顯微鏡觀察結果顯示，KD組及NC組慢病毒對肝癌細胞的感染效率均達到80%以上，KD組SMMC-7721細胞中NCEH1基因的相對表達量僅為NC組細胞的26.0%(0.260±0.035 vs 1.004±0.106，t=11.578，P=0.000 3)，即NCEH1基因在SMMC-7721人肝癌細胞系中的敲減效率達到了74.0%(圖2)。

注：a，KD組熒光視野(×200)；b，NC組熒光視野(×200)；C，KD組明視野(×200)；d，NC組明視野(×200)；e，KD組和NC組實時熒光定量PCR檢測結果比較。

2.4 NCEH1敲減對肝癌細胞生長增殖能力的影響 MTT檢測結果顯示，KD組SMMC-7721肝癌細胞生長速度較NC組明顯減緩(第5天相對增殖倍數為3.055±0.046 vs 4.462±0.060，t=32.100，P=0.000 006)，提示NCEH1基因敲減明顯抑制了肝癌細胞的生長增殖(圖3)。

圖3 MTT檢測實驗結果

2.5 敲減NCEH1基因對肝癌細胞凋亡的影響 Annexin V-APC單染法流式細胞儀檢測顯示，KD組SMMC- 7721肝癌細胞凋亡率明顯高于NC組(6.650%±0.203% vs 3.150%±0.090%，t=27.303，P=0.000 01)，提示敲減NCEH1基因可促進細胞凋亡(圖4)。

2.6 敲減NCEH1基因對肝癌細胞遷移能力的影響 劃痕愈合實驗結果顯示，KD組的SMMC-7721肝癌細胞遷移率明顯低于NC組(34.68%±1.89% vs 54.37%±4.23%，t=9.51，P=0.000 01)，提示敲減NCEH1基因可明顯抑制肝癌細胞的遷移能力(圖5)。

注：a，KD組流式細胞分析結果；b，NC組流式細胞分析結果；c，KD組和NC組肝癌細胞凋亡率比較。

注：a，KD組肝癌細胞劃痕后0 h的熒光照片；b，NC組肝癌細胞劃痕后0 h的熒光照片；c，KD組肝癌細胞劃痕后56 h的熒光照片；c，NC組肝癌細胞劃痕后56h的熒光照片；e，KD組和NC組肝癌細胞遷移率比較。

2.7 敲減NCEH1基因對肝癌細胞轉移能力的影響 Transwell實驗結果顯示，KD組SMMC-7721肝癌細胞的轉移細胞數明顯低于NC組(12.89±3.63 vs 75.04±7.65，t=38.123，P<0.000 1)，提示NCEH1基因敲減可明顯抑制肝癌細胞的轉移能力(圖6)。

注：a，KD組肝癌細胞轉移穿過聚碳脂膜的顯微鏡照片(×100)；b，NC組肝癌細胞轉移穿過聚碳脂膜的顯微鏡照片(×100)；c，KD組和NC組肝癌細胞轉移數比較。

2.8 敲減NCEH1基因對肝癌細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結果顯示，KD組的SMMC-7721肝癌細胞侵襲數明顯低于NC組(63.67±8.86 vs 144.52±16.60，t=22.331，P<0.000 1)，提示NCEH1基因敲減可明顯抑制肝癌細胞的侵襲能力(圖7)。

注：a，KD組肝癌細胞侵襲小室實驗顯微照片(×100)；b，NC組肝癌細胞侵襲小室實驗顯微照片(×100)；c，KD組和NC組肝癌細胞中侵襲細胞數比較。

3 討論

肝癌在全球的發病率和死亡率較高，據估計2015年全球肝癌死亡人數約為80萬[7]，而在全球每年新增肝癌病例中，約一半發生在我國，已成為最致命的癌癥之一[8]。盡管針對肝癌的治療手段眾多，手術切除仍然是治療肝癌的首選方案，但由于肝癌術后復發率相對較高，導致肝癌術后5年無復發生存率僅為38%，嚴重限制了肝癌的總體治療效果[9-10]。因此，探索肝癌侵襲轉移的機制以獲得有效的肝癌治療靶點已成為肝癌研究的重點。

近年來的研究表明，脂代謝異常可能是促進癌癥發生發展的一個重要因素，Jiang等[11]通過蛋白質組學分析發現，改變細胞內膽固醇的分布，可有效抑制肝細胞癌的增殖和轉移。Lin等[12]通過脂質組學分析發現，脂質代謝的改變與腫瘤侵襲性、生長和增殖密切相關，目前也已發現多個脂質代謝過程中的關鍵酶在腫瘤細胞中過表達[13-14]，這為肝癌治療提供了一個新思路。NCEH1是一個蛋白質編碼基因，定位于人染色體3q26.31，大小為80 970 bp。NCEH1基因編碼的蛋白由408個氨基酸組成，大小為45.808 kD，是一種絲氨酸水解酶，在巨噬細胞和中樞神經細胞中有較高表達[15-16]，并在調節膽固醇代謝過程中發揮重要作用[4]。已有研究[17-18]發現，NCEH1表達產物可作為乙醚脂質信號網絡中連接血小板活化因子和溶血磷脂酸的中心節點，抑制NCEH1表達產物可降低癌細胞中的醚脂質代謝并抑制腫瘤細胞遷移和生長。Chang等[5]的研究則發現，選擇性NCEH1抑制劑可明顯降低人前列腺癌細胞系的遷移、侵襲、存活及增殖能力，提示NCEH1可能與腫瘤的侵襲、遷移及增殖相關，但NCEH1在肝癌中的表達水平及作用目前均不清楚。

為此，本研究首先通過對本院32例肝癌及對應癌旁標本進行分析發現，NCEH1在肝癌組織中的表達明顯高于對應的癌旁組織，然后分析ICGC數據庫中日本人群的肝癌基因表達數據發現，NCEH1在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織，與本研究結果一致，提示NCEH1在肝癌組織中的表達上調。繼而，本研究采用實時熒光定量PCR技術分析發現，NCEH1在所有肝癌細胞系中的表達均高于正常肝細胞系，這與其在肝癌組織中表達上調的結果一致。更重要的是，NCEH1在侵襲轉移潛能較高的肝癌細胞系中的表達明顯高于低侵襲轉移潛能的肝癌細胞系，這與Chang等[5]在前列腺癌細胞系中的結果一致，提示NCEH1與肝癌細胞的侵襲轉移相關。本研究采用慢病毒介導的siRNA技術敲減NCEH1在SMMC-7721肝癌細胞系(該細胞系的NCEH1表達水平在筆者檢測的4株肝癌細胞系中為最高)中的表達，結果顯示，NCEH1基因的敲減效率高達74.0%，NCEH1基因敲減的SMMC-7721肝癌細胞系得以成功建立。接下來，本研究采用MTT生長曲線、細胞流式檢測及Transwell轉移和侵襲實驗等一系列細胞功能實驗觀察NCEH1在肝癌細胞中的功能，結果顯示,NCEH1基因敲減可明顯降低肝癌細胞系的增殖、轉移及侵襲能力并促進凋亡，這些結果也均與Chang等[5]在前列腺癌細胞中獲得的結果一致，提示NCEH1可能是一個潛在的肝癌治療靶點。

對于NCEH1表達及發揮作用的分子調控機制的研究相對較少，Cheung等[19]發現在牛皮癬皮膚的皮下脂肪組織中miR-26b-5p高度上調，而NCEH1是miR-26b-5p的直接靶點之一，miR-26b-5p可靶向下調NCEH1的表達。現有的研究顯示，miR-26b-5p在不同腫瘤組織中均起著抑癌作用[20]，其在肝癌細胞系中明顯下調，且與肝癌的侵襲和轉移密切相關[21-22]。而miRNA被認為可調控60%蛋白質編碼基因，并參與幾乎所有細胞過程的調控[18,23]。筆者據此推測miR-26b-5p在肝癌中也可能存在對NCEH1基因表達的負向調控，即miR-26b-5p的下調可能促使NCEH1基因在肝癌組織中的表達上調，并因此增強了肝癌細胞的增殖、凋亡、轉移及侵襲能力。然而，NCEH1在肝癌中表達升高及發揮生物學作用的具體分子機制均尚有待于進一步研究闡明。

綜上所述，本研究結果發現，NCEH1基因在肝癌組織及細胞系中的表達明顯升高，體外實驗中可以促進肝癌細胞增殖、侵襲轉移并抑制凋亡，提示其可能是一個潛在的肝癌治療靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：曾裕文負責資料分析、擬定寫作思路、收集數據、撰寫論文、修改論文；張芳雍、譚國鉗參與指導撰寫文章、收集數據、修改論文；吳帆負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。