轉錄組測序分析高爾基體蛋白73參與調(diào)控肝癌的作用機制

葉佩靈， 嘉紅云， 彭 亮

1 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 檢驗科， 廣州 510260； 2 廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 檢驗科， 廣州 510700

在我國，肝癌是僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤，中國占全球發(fā)病人數(shù)的47%[1]。肝癌的發(fā)病原因尚未明確，以發(fā)展快、療效差和復發(fā)率高為特征，極易發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉移，預后差，5年生存率不足30%。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)高爾基體磷蛋白2/高爾基體蛋白73(golgi phosphoprotein 2，GOLPH2/GP73)的高表達與肝臟疾病有一定的關系[2-3]，尤其與原發(fā)性肝癌關系密切，人們逐漸認識到GP73有可能成為肝癌早期診斷的標志物[4-5]，血清GP73可預測肝細胞癌患者肝切除術后的預后[6]。研究[7]還發(fā)現(xiàn)，有效干擾GP73基因表達后，可明顯抑制人肝癌細胞的遷移和侵襲能力，GP73的表達可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。目前關于GP73通過何種信號通路參與肝癌的發(fā)生發(fā)展的研究較少，為進一步闡明GP73對肝癌的作用機制，本實驗建立了干擾和過表達GP73的Hep3B肝癌細胞模型，采用轉錄組測序檢測不同GP73表達量的肝癌細胞中mRNA表達譜的差異，并進行生物信息學分析，旨在篩選出GP73參與調(diào)控肝癌相關的信號通路，進而為肝癌發(fā)病機制的探索提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 Hep3B細胞株購于廣州賽庫生物技術有限公司；GP73、GAPDH一抗購于Proteintech公司；PI3K、p-AKT和AKT抗體購于CST公司；pcDNA3.1過表達質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒由安徽通用生物科技有限公司提供；干擾片段引物設計、合成和測序由吉瑪生物公司完成；文庫構建試劑盒(NGS00-2013，中國依科賽)；Trizol(TR118-500，MRC)；qRT-PCR試劑盒(Q341-03，Vazyme)，GP73、內(nèi)參GAPDH引物、實時定量PCR引物由捷瑞生物公司合成。PCR儀(StepOne Plus，美國ABI公司)；Illumina 測序平臺(HiSeqTM2000)；生物分析儀(Agilent2100，中國Agilent公司)。

1.2 實驗分組 肝癌細胞Hep3B分為4組進行培養(yǎng)，分別是GP73干擾組:Hep3B+si-GP73；干擾對照組:Hep3B+siRNA NC；GP73過表達組:Hep3B+pcDNA3.1-GP73；過表達對照組:Hep3B+pcDNA3.1。

1.3 重組質(zhì)粒的轉染 細胞消化后，接種至6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。把轉染試劑分別與干擾片段siRNA-GP73、過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-GP73混勻，形成DNA脂復合物，滴加至細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，干擾片段和過表達質(zhì)粒通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞，48 h后提取細胞總RNA, 進行cDNA 逆轉錄。qRT-PCR和Western Blot驗證GP73mRNA的量，干擾組和過表達組GP73 mRNA的量與對照組比較有顯著差異，轉染成功。qRT-PCR反應條件：95 ℃ 120 s熱變性；變性95 ℃ 15 s、退火延伸60 ℃ 30 s，反應40個循環(huán)；溶解曲線60～95 ℃。GP73、內(nèi)參GAPDH引物由捷瑞生物公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.4 文庫構建和測序 轉錄組測序及生物信息學分析由永諾生物科技有限公司完成。從樣本中提取總RNA，以磁珠富集真核生物mRNA；mRNA經(jīng)打斷后以隨機引物

合成一鏈cDNA，再合成二鏈cDNA。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)末端修復，再連接接頭。以磁珠對連接產(chǎn)物進行片段選擇并進行PCR擴增純化回收。cDNA文庫經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀檢測，qPCR定量后以Illumina HiSeqTM2000測序儀進行測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理和功能富集分析 測序所得的數(shù)據(jù)，根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)從不同組別中篩選差異表達的mRNA，得到受GP73調(diào)控的基因。應用超幾何檢驗，GO分析通過與Gene Ontology數(shù)據(jù)庫比較，得到顯著富集的GO條目，從而推斷GP73參與的生物學功能。KEGG分析通過與全基因組比較，獲得受GP73調(diào)控的信號通路。

1.6 Western Blot驗證測序結果 采用Western Blot驗證不同組別GP73和信號通路蛋白表達量的變化。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目標蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜2次，加入HRP標記二抗，室溫孵育1～2 h，TBST洗膜3次后進行化學發(fā)光顯影。使用圖像處理軟件Image J分析目標條帶的光密度值。以GAPDH作為內(nèi)參照，對結果進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，不同實驗組間進行差異分析，符合正態(tài)分布的計量資料2組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 測序數(shù)據(jù)評估 為保證信息分析質(zhì)量，對Hep3B4組細胞的cDNA文庫基因測序得到原始序列(Raw Reads，總計18.3×107個)，經(jīng)過濾和質(zhì)控，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(Clean Reads，18.0×107個，占原始序列的98.36%)。4組樣品的測序數(shù)據(jù)差異較小，堿基質(zhì)量值大于20和30的堿基占總體堿基比例分別為Q20≥97.54%，Q30≥93.26%，表明測序結果較好。

2.2 根據(jù)測序數(shù)據(jù)篩選差異表達基因 cDNA文庫測序分析顯示GP73干擾組、過表達組和對照組測到的共同基因有15 147個(圖1)。運用軟件SOAP根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)對 mRNA表達量進行比較分析，結果顯示：干擾GP73后，差異表達基因一共有1508個，其中表達升高的有327個，表達下降的有1181個；過表達GP73后，差異表達基因一共有731個，其中表達升高的有361個，表達下降的有370個(圖2、3)。在GP73干擾組和過表達組相同的差異表達基因一共有60個，在干擾組中表達下降以及在過表達組中表達升高的有46個；在干擾組中表達升高以及在過表達組中表達下降的有14個(圖4)。

圖1 干擾和過表達GP73后4個組的差異表達基因交叉分布情況

圖2 干擾和過表達GP73后干擾組與過表達組差異表達

注：橫坐標表示對照組樣品基因表達量(取對數(shù))，縱坐標表示實驗組樣品基因表達量(取對數(shù))。實驗組樣品相對于對照組樣品，紅點表示基因表達量上調(diào)的基因，綠點表示基因表達量下調(diào)的基因，藍點表示基因表達量沒有顯著變化的基因。

圖4 干擾和過表達GP73后共同差異表達基因的熱圖

2.3 差異表達基因mRNA功能分析和通路預測

2.3.1 GO功能富集分析 GO功能分析描述基因的3個部分：分子功能、細胞位置、生物過程。根據(jù)測序數(shù)據(jù)篩選滿足條件的差異表達基因與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，應用超幾何檢驗。結果顯示，顯著富集的 GO條目一共有586條(P<0.05)，其中生物過程429條、分子功能88條、細胞位置69條。生物過程顯著差異的前10個條目分別是：細胞過程、單個組織的過程、生物調(diào)節(jié)等條目(圖5)，提示GP73可能通過這些生物學功能參與調(diào)控肝癌。

圖5 差異表達mRNA排名前10位的GO分析富集條目

2.3.2 KEGG富集分析 將差異表達基因和全基因組進行比對，使用超幾何檢驗，獲得Hep3B干擾GP73和過表達GP73后差異表達基因顯著富集的代謝通路。KEGG富集分析顯示：在干擾組，266條信號通路被顯著富集；在過表達組，227條信號通路被顯著富集。在排名前17位的信號通路中有4個與肝癌密切相關，包括PI3K-AKT、細胞因子/細胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT信號通路(圖6)。結果提示GP73可能通過這些信號通路參與肝癌的調(diào)控。同時也發(fā)現(xiàn)了既往報道與肝癌相關的其他重要通路，例如Rap1、NF-κB等信號通路。

2.4 Western Blot驗證PI3K-AKT信號通路 隨機選取KEGG分析排名前10位的與肝癌密切相關的PI3K-AKT信號通路進行驗證。通過Western Blot檢測PI3K-AKT的3個蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表達，比較干擾和過表達GP73后3個蛋白表達的差異。結果顯示，干擾組蛋白PI3K、p-AKT表達量顯著低于對照組(P值均<0.05)；過表達組蛋白PI3K、p-AKT表達量顯著高于對照組(P值均<0.05)(圖7)。Western Blot結果證實了KEGG分析對信號通路的預測，GP73可能是通過激活PI3K-AKT信號通路的相關信號分子PI3K、p-AKT蛋白參與肝癌的調(diào)控過程。

3 討論

肝癌以病情進展快、療效差和復發(fā)率高為特征，發(fā)病機制和病因尚不明確。尋找新的藥物治療靶點，成為研究的動力和方向。GP73是Kladney等[7]在2000年發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型高爾基體膜蛋白，是定位于高爾基體順面膜囊上的磷酸化跨膜蛋白。GP73在健康人肝細胞中很少表達，主要表達于膽管上皮細胞，在上皮細胞的多項病理及生理活動中發(fā)揮著重要作用。作者過往研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，GP73在肝癌患者的血清和肝組織中表達異常升高。也有研究[11]發(fā)現(xiàn)，GP73可通過上調(diào)上皮間質(zhì)轉化促進人肝癌細胞的侵襲性。另外，GP73在轉移性肝癌細胞中也有異常表達，有可能成為肝癌轉移治療的一個新的分子靶點[12]。目前，GP73如何參與肝癌發(fā)病過程的具體機制尚不明確，值得去探究。

注：縱坐標表示KEGG分析的條目，橫坐標表示顯著差異表達基因的比例，點的大小表示顯著差異表達基因的數(shù)目，點的顏色代表顯著性，表示不同的P值(0～1)。

注：*,P<0.05。

本文借助轉錄組測序技術為揭示GP73對肝癌的作用機制以及作為治療肝癌的作用靶點進行研究。在本研究中，對肝癌細胞株Hep3B進行干擾和過表達GP73的處理，采用轉錄組測序分析，得到18.3×107個原始序列，分析顯示4組樣本共同檢測到的基因有15 147個，根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)，對4組樣本的mRNA表達量進行比較分析，結果顯示：干擾GP73后，差異表達基因一共有1508個，過表達GP73后，差異表達基因一共有731個，在干擾組和過表達組相同的差異表達基因一共有60個，其中在干擾組中表達下降以及在過表達組中表達升高的有46個；在干擾組中表達升高以及在過表達組中表達下降的有14個。對差異表達基因進行GO分析顯示：顯著富集的GO條目有586條，其中生物過程429條、分子功能88條、細胞位置69條。生物過程顯著差異的前10個條目分別是：細胞過程、單個組織的過程、生物調(diào)節(jié)等條目，提示GP73可能通過參與這些生物學功能調(diào)控肝癌的發(fā)病過程。KEGG富集分析顯示：在干擾組，266條信號通路被顯著富集，在過表達組，227條信號通路被顯著富集。其中，在排名前17位的信號通路中有4個與肝癌密切相關，包括PI3K-AKT、細胞因子/細胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT信號通路，提示GP73可能通過這些潛在的信號通路參與肝癌的調(diào)控。隨機選取KEGG分析排名前10位的與肝癌密切相關的PI3K-AKT信號通路進行驗證，通過Western Blot檢測PI3K-AKT的3個關鍵蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表達。結果顯示，干擾組PI3K、p-AKT的表達量顯著低于對照組(P值均<0.05)；過表達組PI3K、p-AKT的表達量顯著高于對照組(P值均<0.05)。Western Blot結果證實了KEGG分析對信號通路的預測，GP73可能是通過激活PI3K-AKT信號通路的相關信號分子PI3K、p-AKT蛋白參與肝癌的調(diào)控過程。

綜上所述，通過轉錄組測序技術，發(fā)現(xiàn)GP73對肝癌發(fā)展的調(diào)控機制可能是通過PI3K-AKT、細胞因子/細胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT等信號通路實現(xiàn)，提示GP73有可能成為肝癌治療的新的分子靶點，筆者后續(xù)將繼續(xù)在更多肝癌細胞系深入研究，驗證其作用機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：葉佩靈負責資料分析，撰寫論文；嘉紅云、彭亮負責課題設計,指導文章撰寫。