葡萄糖-6-磷酸脫氫酶表達(dá)與肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系

劉明君， 劉穎娟， 楊 桂， 劉松梅

武漢大學(xué)中南醫(yī)院 檢驗(yàn)科/基因診斷中心/檢驗(yàn)系， 武漢 430071

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其惡性程度高，增殖能力強(qiáng)，患者預(yù)后差。2018年，全球新發(fā)肝癌84.1萬(wàn)例，在惡性腫瘤發(fā)病率排名第6位，死亡78.1萬(wàn)例[1]；2015年我國(guó)的新發(fā)肝癌約37.0萬(wàn)例，死亡人數(shù)約32.6萬(wàn)例[2]。因此，尋找肝癌預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD是參與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的第一種酶，也是PPP的限速酶，糖酵解產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下進(jìn)入PPP，產(chǎn)生細(xì)胞活動(dòng)所需要的能量[3]。研究發(fā)現(xiàn)，G6PD在黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6-7]、肝癌[8-9]、結(jié)直腸癌[10]等惡性腫瘤中表達(dá)升高，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值(LMR)是反映機(jī)體炎癥和免疫狀態(tài)的一項(xiàng)敏感指標(biāo)，已被證實(shí)可用于預(yù)測(cè)卵巢癌[11]、肺癌[12]和肝癌[13]等實(shí)體腫瘤的預(yù)后。本文通過分析G6PD在肝癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，以及不同G6PD表達(dá)水平患者的臨床指標(biāo)差異，探討G6PD表達(dá)在HCC預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年6月—2018年1月在本院就診的44例首診HCC患者的肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，及其臨床信息和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[14]；(2)有完整的基本資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果(肝腎功能、血常規(guī)、凝血指標(biāo)和腫瘤標(biāo)志物)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或有全身感染癥狀；(2)術(shù)前接受過其他方式治療。

1.2 儀器試劑 采用貝克曼奧林巴斯5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝腎功能，貝克曼庫(kù)爾特全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀H750檢測(cè)血常規(guī)。貝克曼ACLTOP檢測(cè)凝血指標(biāo)。BeckmanDX1800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定AFP。BIO-RAD熒光定量 PCR系統(tǒng)CFX ConnectTM檢測(cè)基因表達(dá)。

1.3 方法 使用Trizol(美國(guó)Thermo公司)提取組織RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FSQ-301(日本TOYOBO公司)合成cDNA。β-actin為內(nèi)參基因,進(jìn)行qPCR。G6PD：上游5′-AACATCGCCTGCGTTATCCTC-3′,下游5′-ACGTCCCGGATGATCCCAA-3′；β-actin：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTC AGTC-3′。

用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析G6PD在HCC組織中的表達(dá)。Kaplan Meier Plotter(KM plotter)數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估HCC組織中G6PD表達(dá)水平與預(yù)后。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)： 2017058。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中G6PD mRNA表達(dá) 運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)44例HCC患者肝癌組織和癌旁肝臟組織中G6PD的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G6PD mRNA在癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(Z=-3.221，P=0.001)，癌組織G6PD表達(dá)水平是癌旁組織的2.09倍(圖1a)。

注：a， HCC患者癌組織和癌旁組織G6PD mRNA表達(dá)水平比較；b，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中G6PD在肝癌組織中表達(dá)；c，G6PD高表達(dá)和低表達(dá)患者總生存曲線；d，G6PD高表達(dá)和低表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存曲線。

2.2 低G6PD組和高G6PD組的HCC患者基本資料 根據(jù)G6PD mRNA表達(dá)水平中位數(shù)，將患者分為G6PD高表達(dá)組(n=22)及低表達(dá)組(n=22)。兩組患者在年齡、性別、HBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率和TNM分期上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2.3 肝癌患者預(yù)后與G6PD表達(dá)的關(guān)系分析 運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝癌組織(n=369)和癌旁組織(n=160)中的G6PD表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G6PD在癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)(圖1b)。運(yùn)用KM plotter數(shù)據(jù)庫(kù)，分析兩組患者預(yù)后差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G6PD高表達(dá)是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素：總生存期(HR=1.84，95%CI： 1.30～2.61;P=0.000 52)和無(wú)進(jìn)展生存期(HR=1.75，95%CI： 1.27～2.42；P=0.000 54)，即G6PD高表達(dá)患者預(yù)后不良(圖1c、d)。

2.4 肝癌組織中G6PD表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 為了進(jìn)一步比較肝癌患者中G6PD mRNA表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系，比較HCC患者低G6PD組(n=22)和高G6PD組(n=22)的肝功能、血常規(guī)、凝血功能和AFP差異。

結(jié)果顯示，LMR在高G6PD組患者中明顯低于低G6PD組(P=0.011)，其他指標(biāo)兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 肝癌患者G6PD表達(dá)水平與術(shù)前臨床指標(biāo)關(guān)系

2.5 G6PD表達(dá)與LMR相關(guān)性分析 進(jìn)一步分析G6PD mRNA表達(dá)量與LMR相關(guān)性，結(jié)果顯示G6PD表達(dá)水平與LMR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.439,P=0.005)(圖2), 提示G6PD表達(dá)與免疫功能、炎癥狀態(tài)有關(guān)。

圖2 G6PD mRNA表達(dá)與LMR相關(guān)性

3 討論

HCC是一種進(jìn)展迅速，惡性程度高，預(yù)后極差的腫瘤[15]。隨著各種分子生物學(xué)層面的研究深入，越來(lái)越多的研究表明肝癌的發(fā)生發(fā)展常伴隨著糖代謝紊亂[16]、多種基因表達(dá)改變和信號(hào)通路異常[17]。

腫瘤細(xì)胞由于瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect)主要通過糖酵解的方式分解葡萄糖獲能，所產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖可以通過PPP為核苷酸、脂質(zhì)等生物分子合成提供前體以及NADPH[16,18]。本研究發(fā)現(xiàn)G6PD基因在HCC中表達(dá)明顯高于配對(duì)癌旁組織。相關(guān)研究指出，PI3K/Akt、Ras和Src等促癌信號(hào)通路的過度激活，可通過翻譯后調(diào)控機(jī)制促進(jìn)G6PD激活[3]，從而引起腫瘤組織中G6PD表達(dá)升高，產(chǎn)生的高水平NADPH可以減少細(xì)胞活性氧(ROS)的生成[19]。ROS在多種癌癥中被檢測(cè)到，一方面被認(rèn)為可以激活腫瘤信號(hào)，但同時(shí)ROS累積也能啟動(dòng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，腫瘤細(xì)胞G6PD表達(dá)升高，可以減少升高的ROS，建立氧化還原平衡[20]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS累積會(huì)引起NF-κB的激活，可引起大量細(xì)胞因子如IL-6、IL-24、IL-32等的釋放，細(xì)胞因子招募單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞到腫瘤部位，引起腫瘤微環(huán)境炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[21]。

已經(jīng)有研究證實(shí)HBV感染會(huì)引起G6PD的升高[22]，同時(shí)HBV感染可能會(huì)引起腫瘤微環(huán)境炎癥反應(yīng)，引起免疫細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)改變[23]。而高LMR是多種癌癥預(yù)后的保護(hù)因素[9,24]，在肝癌的相關(guān)研究[25]中，肝癌術(shù)前LMR可分為高值組(≥3.03)和低值組(<3.03)，高LMR組患者肝癌切除術(shù)后5年生存率較好。也有學(xué)者[26]指出肝移植術(shù)后LMR<2.75的患者的5年生存率明顯低于LMR≥2.75的患者。而本研究發(fā)現(xiàn)LMR在G6PD高表達(dá)組中明顯低于G6PD低表達(dá)組，且肝癌組織中G6PD表達(dá)水平與LMR呈負(fù)相關(guān)，提示G6PD高表達(dá)的HCC患者不良預(yù)后可能與腫瘤微環(huán)境炎癥有關(guān)。

綜上，在肝癌組織中高G6PD的表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，G6PD高表達(dá)和低表達(dá)組的LMR有明顯差異，且G6PD的表達(dá)量與LMR呈負(fù)相關(guān)，提示G6PD表達(dá)可能與腫瘤微環(huán)境炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究所用樣本量較小，具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉明君負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，撰寫論文； 劉穎娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；楊桂、劉松梅負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。